Thực tế có nhiều cách để xác định loại vi khuẩn, trong đó nhuộm gram là phương pháp được sáng chế năm 1884 và vẫn có giá trị cho đến ngày nay để phân loại vi khuẩn nhanh thành 2 nhóm lớn với đặc tính riêng biệt.
Nhuộm gram là phương pháp dựa trên đặc tính lý hóa của thành tế bào mà phân loại vi khuẩn thành 2 loại là vi khuẩn gram âm và vi khuẩn gram dương. Nhuộm gram có thể được thực hiện trên cả dịch cơ thể hoặc trên mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn.
Nhuộm gram là phương pháp xác định loại vi khuẩn nhanh hơn nuôi cấy có ý nghĩa giúp phân biệt sớm các bệnh do nhiễm khuẩn để xác định hướng điều trị cũng như tiên lượng bệnh. Các thuốc thử cần sử dụng cho phương pháp này gồm có:
- Dung dịch tím Gentian
- Dung dịch Lugol
- Cồn tẩy 950
- Dung dịch đỏ Fuchsin pha loãng 1/10
Nhuộm gram có thể xác định được loại vi khuẩn gram âm hay gram dương nhanh hơn phương pháp nuôi cấy
Quy trình nhuộm gram sẽ gồm các bước sau:
- Dàn đều bệnh phẩm hoặc vi khuẩn lên lam kính sạch;
- Cố định mẫu bệnh phẩm bằng cách hơ trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội;
- Các bước nhuộm:
- Đầu tiên phủ dung dịch tím Gentian và để khoảng 30 giây sau đó rửa dưới vòi nước chảy nhẹ. Bước này sẽ giúp nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tím đen
- Tiếp theo phủ dung dịch Lugol để cố định màu, cũng để khoảng 30 giây rồi rửa dưới vòi nước. Dung dịch sẽ giúp gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tùy thuộc vào loại của nó
- Tẩy màu bằng cồn 950 để khoảng 30 giây và rửa nước. Đây là bước rất quan trọng để phân biệt loại vi khuẩn đã được dung dịch Lugol gắn chắc màu tím vào và loại màu tím bị tẩy trôi
- Cuối cùng phủ dung dịch đỏ Fuchsin 1/10 của Gram để khoảng 30 giây rồi rửa dưới vòi nước sẽ làm các vi khuẩn đã được tẩy hết màu tím bắt lại màu đỏ, những vi khuẩn đã bị nhuộm tím đen sẽ không bị ảnh hưởng.
- Để khô tự nhiên
- Soi dưới vật kính dầu
Vi khuẩn có đặc điểm là lớp peptidoglycan dày ở thành tế bào giúp giữ các phức hợp tím tinh thể nên sau khi nhuộm gram sẽ bắt màu tím sẫm Gentian và không bị tẩy màu sau dùng cồn tẩy 950. Những vi khuẩn này sẽ được phân loại là vi khuẩn gram dương như: tụ cầu, phế cầu, liên cầu,...
Vi khuẩn có lớp peptidoglycan mỏng hơn và có thêm lớp màng lipopolysaccharide bên ngoài không thể giữ lại phức hợp tím tinh thể-iod và sẽ bị khử màu. Sau đó khi dùng dung dịch Fuchsin 1/10 phủ lên thì những vi khuẩn này sẽ bắt màu đỏ hoặc hồng. Các vi khuẩn này sẽ được phân loại là vi khuẩn gram âm.
Như vậy có thể thấy bước tẩy màu rất quan trọng và cần phải có kỹ năng nhất định vì khả năng bắt màu của Gram dương không phải là tuyệt đối.
Vi khuẩn tụ cầu được phân loại là vi khuẩn gram dương sau khi nhuộm gram
Vi khuẩn gram dương giả do các yếu tố sau:
- Tiêu bản được cố định khi chưa khô hoặc quá dày
- Màu của cặn thuốc nhuộm gây sai lệch kết quả
- Lugol chưa được đổ hết để cố định màu
- Cổn tẩy chưa đủ thời gian để phân biệt chính xác
- Dung dịch Fuchsin quá đậm hoặc nhuộm quá lâu
Vi khuẩn gram âm giả do các nguyên nhân như không thay Lugol hoặc tẩy cồn quá lâu và không tráng kỹ.
XEM THÊM:
- Vi khuẩn là gì? Có những loại nào?
- Sự hình thành và sinh sản của vi khuẩn
- Vi khuẩn gram dương là gì?
Nguồn tham khảo: Bệnh viện Vinmec
Nhuộm Gram là một phương pháp thực nghiệm nhằm phân biệt các loài vi khuẩn thành 2 nhóm. Gram dương [Gram positive] và Gram âm [Gram negative] dựa trên các đặc tính hoá lý của thành tế bào. Phương pháp này được đặt tên theo người phát minh ra nó, nhà khoa học người Đan Mạch Hans Christian Gram [1853 -1938]. Ông phát triển kỹ thuật này vào năm 1884, về sau được Hucker và nhiều người khác cải tiến.
NỘI DUNG KỸ THUẬT NHUỘM GRAM VI KHUẨN
Nguyên lý của kỹ thuật nhuộm Gram
Vi khuẩn bắt màu Gram âm hay Gram dương do sự khác nhau về thành phần, cấu trúc vách tế bào của vi khuẩn.
Vi khuẩn Gram dương có lớp peptidoglycan dầy, nhiều acid teichoic, chúng không bị ảnh hưởng bởi sự tẩy màu bằng cồn, vẫn giữ nguyên được màu tím ban đầu nếu vách tế bào không bị ảnh hưởng bởi các yếu tố như tuổi, tác dụng của kháng sinh...
Vi khuẩn Gram âm có một lớp peptidoglycan gắn với lớp phospholipid kép, xen kẽ các protein ở màng ngoài, lớp màng này dễ bị phá hủy bởi cồn khi tẩy màu, do đó phức hợp tinh thể tím gentian - iod không bền, bị tẩy màu và màu được thay bởi các thuốc nhuộm khác.
Dụng cụ, thiết bị
- Tủ an toàn sinh học [ATSH] cấp 2
- Kính hiển vi quang học.
- Máy ly tâm
- Máy trộn, lắc
- Ống vô trùng có nắp đậy.
- Đèn cồn, que cấy, lam kính, lá kính mỏng, bút viết kính, dầu soi kính, giấy thấm dầu.
- Pipet Pasteur vô trùng.
Vật liệu, hoá chất
[1] Các loài vi khuẩn hoặc các hỗn dịch các vi khuẩn này. Vi khuẩn Gram âm: E.coli, Salmonella,..; Gram dương: S. aureus, Bacillus cereus; dịch cơ thể hoặc mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn.
[2] Dung dịch tím gentians
[3] Dung dịch Lugol
[4] Dung dịch alcohol 90%
[5] Dung dịch fucshin kiềm
Các bước tiến hành kỹ thuật nhuộm Gram
Bước một, dàn tiêu bản và cố định tiêu bản:
Dùng que cấy vô trùng lấy một ít vi khuẩn từ ống giống thạch nghiêng [hoặc dịch cơ thể, mẫu sinh thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn]. Hoà vào 1 giọt nước muối sinh lý ở giữa phiến kính, để khô trong phòng thí nghiệm.
Cố định tiêu bản bằng cách hơ nhanh trên ngọn lửa đèn cồn 2-3 lần để gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính. Việc cố định nhằm 3 mục đích: giết chết vi khuẩn, gắn chặt vi khuẩn vào phiến kính và làm vết bôi bắt màu tốt hơn vì các tế bào chết bắt màu tốt hơn các tế bào sống.
Bước hai, nhuộm màu:
– Thứ nhất, nhuộm bằng dung dịch tím gentians trong 30 giây đến 1 phút, rửa nước;
– Thứ hai, nhuộm thêm dung dịch lugol và giữ trong 1 phút, rửa nước;
– Thứ ba, khử màu: nhỏ dung dịch alcohol 90%, giữ khoảng 30 giây [cho đến khi vừa thấy mất màu], rửa nước;
– Thứ tư, nhuộm tiếp bằng dung dịch Fucshin trong 1 phút, rửa nước, để khô.
* Kết quả: quan sát ở vật kính dầu 100x. Nếu nhuộm đúng vi khuẩn Gram dương bắt màu tím, Gram âm bắt màu hồng.
Giải thích tính bắt màu Gram của vi khuẩn
Vi khuẩn Gram dương có vách tế bào dày từ 15 đến 50 nm, dạng lưới, cấu tạo bởi peptidoglycan. Chất này có khả năng giữ phức hợp tím gentians – iod. Trong khi đó, lớp vách tế bào peptidoglycan của các vi khuẩn Gram âm thì mỏng hơn và thường có thêm lớp màng lipopolysaccharde [LPS] bên ngoài.
Sau khi nhuộm với phức hợp gentians – iod, mẫu được xử lí tiếp với hỗn hợp khử màu, làm mất nước của các lớp peptidoglycan trong vách tế bào Gram dương. Từ đó làm giảm khoảng trống giữa các phân tử và khiến vách tế bào bắt giữ phức hợp gentians – iod bên trong tế bào.
Đối với vi khuẩn Gram âm, dung dịch alcohol 90% đóng vai trò là chất hoà tan lipit và làm tan màng ngoài của vách tế bào. Lớp peptidoglycan mỏng [chỉ khoảng 10 nm] không thể giữ lại phức hợp gentians – iod và tế bào Gram âm bị khử màu và bắt màu thuốc nhuộm bổ sung.
Những sai lầm có thể gặp trong phương pháp nhuộm Gram
– Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram dương nhuộm thành màu hồng của vi khuẩn Gram âm, đó là:
+ Phết vi khuẩn ở lứa cấy qúa già [trên 24h], cấu trúc vách vi khuẩn gram dương không còn bền chặt như ở lứa cấy trẻ, do vậy mất khả năng ngăn cản sự tẩy màu của alcohol.
+ Dung dịch lugol không còn tốt, do đã pha quá lâu và mất đi iod. Trường hợp này có thể nhận biết khi dung dịch lugol không còn sậm màu.
+ Tẩy màu bằng alcohol quá lâu đã làm cho vi khuẩn Gram dương cũng bị tẩy màu.
– Có những sai lầm trong phương pháp nhuộm Gram làm cho vi khuẩn Gram âm nhuộm thành màu tím của vi khuẩn Gram dương, đó là:
+ Phết vi khuẩn quá dầy làm cho alcohol không thể tẩy màu toàn bộ vi khuẩn trong phết nhuộm.
+ Tẩy màu bằng alcohol quá ngắn hay dung dịch alcohol bị pha quá loãng làm cho màu Gram không được tẩy khỏi tế bào vi khuẩn.
HIỆN NAY MELAB DIAGNOSTICS CUNG CẤP BỘ NHUỘM GRAM “MELAB GRAM COLOR SET” GỒM ĐẦY ĐỦ CÁC HÓA CHẤT CẦN THIẾT CHO VIỆC TIẾN HÀNH NHUỘM GRAM VỚI CÁC MẪU BỆNH PHẨM, THỰC PHẨM,...
Tìm hiểu thêm về sản phẩm tại đây: MELAB GRAM COLOR SET
Nhuộm Gram là một phương pháp nhuộm do Gram sáng chế năm 1884. Phương pháp này giúp phân biệt vi khuẩn bắt màu Gram [Gram dương] và vi khuẩn không bắt màu Gram [Gram âm], từ đó giúp cho việc chẩn đoán xác định loại vi khuẩn.
Chuẩn bị thuốc thử
- Dung dịch tím Gentian.
- Dung dịch Lugol.
- Cồn tẩy 950.
- Dung dịch đỏ Fuchsin pha loãng 1/10.
Kỹ thuật nhuộm Gram
[1]. Dàn bệnh phẩm hoặc vi khuẩn lên trên lam kính sạch.
[2]. Cố định bằng cách hơ qua trên ngọn lửa đèn cồn. Để nguội.
[3]. Nhuộm:
- Phủ dung dịch tím Gentian, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước chảy nhẹ.
- Phủ dung dịch Lugol để cố định màu, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.
- Tẩy mầu bằng cồn 950, để khoảng 30 giây. Rửa nước.
- Phủ dung dịch đỏ Fucshin 1/10 của Gram, để khoảng 30 giây. Rửa dưới vòi nước.
[4]. Để khô tự nhiên.
[5]. Soi dưới vật kính dầu.
Nguyên tắc nhuộm
Nhuộm tím Gentian: Nhuộm tất cả vi khuẩn thành màu tím đen.
Nhỏ Lugol: Gắn màu tím vào vi khuẩn đậm hay nhạt tuỳ loại.
Tẩy cồn 950: Tẩy màu một số vi khuẩn mà dung dịch lugol không gắn chắc màu tím vào được. Không tẩy màu một số vi khuẩn mà màu tím đã được dung dịch lugol gắn chắc vào. Bước tẩy cồn rất quan trọng nên phải thật chú ý trong quá trình nhuộm.
Nhuộm đỏ Fuchsin: Nhuộm đỏ trở lại những vi khuẩn đã bị cồn tẩy màu. Không có tác dụng trên vi khuẩn đã bị nhuộm tím đen.
Cơ chế bắt màu Gram
Có sự khác biệt giữa vi khuẩn Gram [+] và vi khuẩn Gram [-] về cấu tạo của lớp peptidoglycan [murein] ở thành tế bào vi khuẩn.
Các vi khuẩn Gram [+] có lớp peptidoglycan dày hơn làm cho vi khuẩn giữ chắc màu tím gentian và không bị tẩy màu bởi cồn. Sau khi nhuộm fuchsin, vi khuẩn không bắt màu đỏ mà vẫn giữ nguyên màu tím, đó là vi khuẩn Gram [+].
Các vi khuẩn Gram [-] có lớp peptidoglycan mỏng hơn làm cho vi khuẩn không giữ được màu tím gentian và bị tẩy màu bởi cồn trở thành không màu. Khi nhuộm fuchsin vi khuẩn bắt màu đỏ, đó là vi khuẩn Gram [-].
Đọc kết quả nhuộm Gram
Vi khuẩn Gram [+] bắt màu tím sẫm Gentian: Tụ cầu, liên cầu, phế cầu, trực khuẩn khuẩn bạch hầu, trực khuẩn than.
Vi khuẩn Gram [-] không bắt màu tím Gentian nên có màu đỏ Fucshin: Lậu cầu, não mô cầu, E. coli, Shigella, Salmonella, tả.
Lưu ý về nguyên nhân nhuộm sai
Gram dương giả
- Do tiêu bản được cố định khi chưa khô, tiêu bản quá dầy.
- Cặn thuốc nhuộm [phải lọc trước khi dùng].
- Đổ chưa hết Lugol.
- Tẩy cồn chưa đủ thời gian.
- Dung dịch fuchsin quá đậm hay nhuộm quá lâu.
Gram âm giả
- Do không thay lugol
- Tẩy cồn quá lâu và tráng không kỹ.
Bệnh viện Bạch Mai