Hiện nay việc chẩn đoán bệnh ký sinh trùng bao gồm nhiều phương pháp giúp phát hiện nhiều loại ký sinh trùng đang “ký sinh” trên cơ thể làm hại sức khỏe để từ đó đưa ra cách loại bỏ chúng. Tùy vào diễn biến cũng như triệu chứng của bệnh nhân, bác sĩ sẽ chỉ định một số phương pháp chẩn đoán đối với từng bệnh nhân. Hầu hết tất cả các bệnh viện và phòng khám hiện nay điều sử dụng kỹ thuật Elisa.
Kỹ thuật Elisa phát hiện hầu hết các loại ký sinh trùng xâm nhập vào cơ thể người thông qua đáp ứng miễn dịch của cơ thể đối với loại ký sinh trùng đó. Tuy nhiên tùy theo mỗi loại ký sinh trùng mà độ đặc hiệu của kháng thể đáp ứng với các căn nguyên đó. Một số kít Elisa phát hiện ký sinh trùng như giun đũa chó,… có độ chính xác rất cao, độ đặc hiệu đạt 93.3 %.
Sau đây chúng ta tìm hiểu về kỹ thuật Elisa tìm giun đũa chó
Phương pháp xét nghiệm tìm giun đũa chó là miễn dịch hấp thụ liên kết enzyme. Kỹ thuật xét nghiệm phức hợp Sandwich. Toxocara Elisa Kit là xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết enzyme [Elisa] dùng để phát hiện định tính kháng thể IgG kháng Toxocara trong mẫu huyết thanh người.
Nguyên tắc xét nghiệm
Vi giếng được phủ kháng nguyên ngoại tiết của ấu trùng Toxocara. Trong bước ủ đầu tiên với huyết thanh của bệnh nhân, nếu có bất kỳ kháng thể hiện, chúng sẽ liên kết với các giếng phủ kháng nguyên trong quá trình ủ đầu tiên. Tiếp theo, các giếng phải được rửa bỏ những phần còn lại cảu mẫu, và thêm vào là enzyme liên hợp. Trong lần ủ thứ hai, enzyme liên hợp sẽ liên kết với bất kỳ kháng thể có mặt. Sau khi rửa lần 2, chất tạo màu [tetramethylbenzidine hoặc TMB] được thêm vào. Với sự hiện diện của enzyme liên hợp, peroxidase xúc tác sử dụng peroxide để biến chất tạo màu thành màu xanh. Màu xanh chuyển sang màu vàng sau khi bổ dung dịch dừng phản ứng STOP. Kết quả được đọc bằng mắt hoặc sử dụng máy đọc Elisa.
Chuẩn bị
Trước khi sử dụng, ta mang tất cả thuốc thử và mẫu để tại nhiệt độ phòng [15-25 oC].
Dịch rửa đậm đặc [20X] có thể kết tủa khi bảo quản trong tủ lạnh, nhưng sẽ trở thành dung dịch khi đưa về nhiệt độ phòng và trộn. Đảm bảo rằng dịch rửa đậm đặc [20X] là hoàn toàn thành dung dịch trước khi pha loãng thành nồng độ hoạt động.
Quy trình xét nghiệm
Lưu ý:
Chắc rằng mẫu và thuốc thử phải để tại nhiệt độ phòng [15-25 oC].
Khi chạy xét nghiệm, cố gắng tránh tạo bọt trong giếng. Bọt có thể ảnh hưởng đặc tính kỹ thuật và việc đọc kết quả cuối. Đập giếng ngược lên khăn thấm sau mỗi bước để giúp giảm thiểu việc tạo bọt trong giếng.
Chứng âm và dương được cung cấp đã pha loãng trước. Không pha loãng thêm.
Các bước tiến hành
Bẻ ra số giếng cần thiết [hai cho đối chứng cộng với số lượng mẫu] và đặt trong khung giữ thanh vi giếng.
Pha loãng huyết thanh bệnh nhân tỷ lệ 1:64 với đệm pha loãng.
Thêm 100 µl chứng âm vào giếng # 1,100 µl chứng dương vào giếng # 2 và 100 µl mẫu xét nghiệm đã pha loãng vào các giếng còn lại.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó rửa 5 lần. Sau lần rửa cuối, Đập giếng lên khăn giấy để loại bỏ nước còn sót lại.
Thêm 100µl Enzyme Liên hợp vào mỗi giếng.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó rửa 5 lần. Sau lần rửa cuối, Đập giếng lên khăn giấy để loại bỏ nước còn sót lại.
Thêm 100µl chất bắt màu TMB vào mỗi giếng.
Ủ ở nhiệt độ phòng xét nghiệm trong 5 phút.
Thêm 100µl dung dịch dừng phản ứng STOP vào mỗi vi giếng. Trộn bằng cách gõ nhẹ khung giữ bằng ngón tay khoảng 15 giây.
Đọc kết quả trong vòng một giờ sau khi thêm dung dịch dừng phản ứng.
Quy trình rửa cho máy rửa tự động và bán tự động
Thực hiện rửa [5] lần trên một bước thay vì ba lần.
Thiết lập máy để “ngâm” một phút giữa mỗi bước rửa.
Sau mỗi bước rửa, đập giếng lên khăn thấm.
Đọc kết quả
Máy đọc Elisa: đọc mức Zero với không khí. Thiết lập đọc bước sóng kép tại 450/620-650 nm.
Giải thích kết quả - máy đọc Elisa
Đọc Elisa mức Zero với không khí. Đọc tất cả các giếng tại 450/650 - 620 nm.
Dương tính: kết quả đọc độ hấp thụ cao hơn 0,3 đơn vị OD
Âm tính: kết quả đọc độ hấp thụ thấp hơn 0,3 đơn vị OD.
Giải thích kết quả - đọc bằng mắt
So sánh kết quả với đối chứng, kết quả được cho là dương tính nếu sự tạo màu rõ rệt và có ý nghĩa.
Quản lý chất lượng
Sử dụng thuốc chứng cho phép xác nhận độ ổn định của bộ xét nghiệm. Các bộ xét nghiệm không nên được sử dụng nếu bất kỳ thuốc chứng nào vượt ra khỏi phạm vi. Giá trị dự kiến cho các thuốc chứng là:
Chứng âm: 0,0 đến 0,3 đơn vị OD.
Chứng dương: 0,5 đơn vị OD trở lên.
Chẩn đoán nhiễm Toxocara không nên được thực hiện chỉ dựa trên kết quả của một xét nghiệm ELISA Toxocara, mà phải kết hợp với các dấu hiệu lâm sàng và triệu chứng khác và những phát hiện trong phòng thí nghiệm khác.
Các yếu tố dịch tễ học, lâm sàng, vùng đặc hữu, và kết quả xét nghiệm khác cần được xem xét khi thực hiện một chẩn đoán.
Bảo quản mẫu
Các chất phản ứng, thanh vi giếng và các thành phần đóng chai bảo quản tại 2 - 8ºC.
Bình tia chứa đệm rửa pha loãng có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng.
Liên hệ xét nghiệm và điều trị ký sinh trùng giun sán tại Phòng khám bệnh giun sán, 76 Trần Tuấn Khải, phường 5, quận 5. Là phòng khám Chuyên khoa Nội Ký sinh trùng uy tín tại TP. HCM. Giờ mở của từ 7 giờ sáng đến 5 giờ chiều, hoạt động từ thứ 2 đến thứ 7, nghỉ ngày CN. Phòng khám do các bác sĩ Chuyên khoa Ký sinh trùng giàu kinh nghiệm thành lập, trực tiếp khám và điều trị bệnh giun sán, đảm bảo mọi quyền lợi cho người bệnh./.
Bác sĩ. Lê Giang
PHÒNG KHÁM KÝ SINH TRÙNG
76 TRẦN TUẤN KHẢI, TP.HCM
TRỊ MẨN NGỨA DA DO GIUN SÁN
ĐC: 76 Trần Tuấn Khải, P.5, Q.5, TP. HCM
Bác sĩ của bạn: 0877688286
Làm việc từ thứ 2 - 7, Nghỉ ngày CN
Ăn sáng là bữa ăn rất quan trọng, cung cấp năng lượng cho cả một ngày làm việc. Ăn sáng đúng cách sẽ cung cấp năng lượng, giúp cơ thể sảng khoái, tỉnh táo...
Xem: 2958Cập nhật: 02.01.2022
Bệnh thương hàn có thể dẫn đến một số triệu chứng như : sốt cao, nôn mửa, gây các biến chứng như viêm phổi, viêm não, thậm chí tử vong.
Xem: 3023Cập nhật: 30.12.2021
Một số loại thuốc như hạ sốt, trị ho, dị ứng, dạ dày, tiêu chảy... cần có sẵn trong nhà, tuy nhiên các bác sĩ khuyến cáo rằng " thuốc là con dao hai lưỡi,...
Xem: 3212Cập nhật: 27.12.2021
Một số triệu chứng phổ biến hằng ngày như sốt, khó nói, khó nuốt hay mệt mỏi, kém tập trung....dễ nhầm lẫn với các bệnh lý khác. Nhưng đó cũng là 1 trong...
Xem: 3283Cập nhật: 25.12.2021
ĐỊNH LƯỢNG KHÁNG THỂ KHÁNG nDNA BẰNG
KỸ THUẬT MIỄN DỊCH GẮN MEN [ELISA]
[Anti – nDNA quantitative test by ELISA]
NGUYÊN LÝ
Kháng nguyên nDNA được gắn sẵn trong các giếng nhựa sẽ kết hợp với kháng thể đặc hiệu anti – nDNA IgG - IgM [nếu có] trong huyết thanh người bệnh khi ủ tạo nên phức hợp Kháng nguyên - Kháng thể đặc hiệu. Sau khi rửa bỏ huyết thanh thừa, cho chất cộng hợp [còn gọi là conjugate] có bản chất là hỗn hợp anti IgG và anti IgM người gắn enzym peroxidase. Khi đó cộng hợp sẽ gắn đặc hiệu vào phức hợp Kháng nguyên - Kháng thể [nếu có]. Sau khi rửa bỏ lượng cộng hợp dư thừa không gắn với phức hợp Kháng nguyên - Kháng thể, cho tiếp vào giếng phản ứng một lượng xác định cơ chất TMB/H2O2 . Enzym peroxidase trong giếng phản ứng [nếu có] sẽ xúc tác tạo phản ứng giữa H2O2 và TMB tạo màu xanh lá cây. Phản ứng được ngừng lại bằng dung dịch a - xít H2SO4 loãng, lúc này màu xanh của dung dịch chuyển thành màu vàng chanh, đậm độ màu tương quan thuận với nồng độ kháng thể IgG và IgM có trong huyết thanh. Xác định mức độ màu bằng phương pháp đo mật độ quang [OD] ở bước sóng 450 nm hoặc bước sóng kép 450 nm/620 nm.
CHỈ ĐỊNH
Các trường hợp nghĩ đến bệnh tự miễn.
CHỐNG CHỈ ĐỊNH
Không có chống chỉ định.
CHUẨN BỊ
Người thực hiện
Kỹ thuật viên và cử nhân đã được đào tạo thực hiện kỹ thuật;
Bác sĩ xét nghiệm: đọc kết quả, đánh giá, kiểm tra chất lượng.
Phương tiện - Hóa chất
Phương tiện
Máy ly tâm ống máu.
Pipet và đầu pipet loại 25µl và 1000µl.
Dàn máy ELISA [tự động hoặc bán tự động].
Găng tay.
Hóa chất
Kít định tính nDNA IgG/IgM gồm các thành phần sau:
Dung dịch pha loãng mẫu;
Dung dịch rửa;
Chứng âm [negative control];
Chứng dương [positive control];
Chứng ngưỡng [cut - off calibrator];
Các nồng độ kháng thể chuẩn [calibrator]: thường có 6 nồng độ chuẩn, giá trị cụ thể của các ống nồng độ chuẩn tùy thuộc vào hãng sản xuất;
Dung dịch cộng hợp [conjugate]: 1 lọ cộng hợp gồm cả IgG và IgM dùng để phát hiện kháng thể IgG và IgM;
Cơ chất tạo mầu [TMB substrate];
Dung dịch dừng phản ứng [stop solution];
Các giếng phản ứng trên phiến nhựa ELISA;
Nước cất, hoá chất khử trùng Natri hypoclorite.
Mẫu bệnh phẩm
Mẫu dùng là huyết thanh;
Cần tách huyết thanh càng sớm càng tốt để tránh hiện tượng tan máu làm ảnh hưởng đến kết quả phản ứng;
Nếu có lẫn hồng cầu hoặc những thành phần hữu hình trong mẫu huyết thanh thì cần ly tâm mẫu để loại bỏ các thành phần đó trước khi xét nghiệm;
Mẫu huyết thanh bảo quản ở nhiệt độ 2oC đến 8oC có thể dùng làm xét nghiệm trong vòng 7 ngày. Nếu muốn để lâu hơn mới xét nghiệm cần phải bảo quản ở tủ lạnh sâu [≤ - 20oC]. Tuy nhiên với mẫu bảo quản lạnh sâu cần tránh đông - tan nhiều lần.
CÁC BƯỚC TIẾN HÀNH
Pha loãng mẫu 100 lần bằng dung dịch pha loãng mẫu [cung cấp theo kít].
Nhỏ 100µl các nồng độ chuẩn [calibrator], mẫu chứng âm, chứng dương, các mẫu thử vào các giếng trên phiến theo sơ đồ định sẵn.
Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
Nhỏ 100µl cộng hợp [conjugate] vào các giếng.
Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Rửa 3 lần bằng dung dịch rửa, 300µl /giếng/lần.
Nhỏ 100µl cơ chất tạo mầu [TMB subtrate] vào mỗi giếng.
Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng.
Nhỏ 100µl dung dịch dừng phản ứng [stop solution] vào mỗi giếng theo đúng trình tự nhỏ TMB.
Ủ tối thiểu 5 phút. Gõ nhẹ vào thành giếng trong 5 giây để trộn đều.
Đọc phiến ở bước sóng 450/620 nm [tốt hơn thì dùng bước sóng kép 450/ 620 nm] trong vòng 30 phút sau khi ủ dung dịch ngừng phản ứng.
Phân tích kết quả.
NHẬN ĐỊNH KẾT QUẢ
Căn cứ vào nồng độ chuẩn ghi trên các ống calibrator và mật độ quang đo được [chỉ số OD], nhập số liệu vào chương trình Exel để tính nồng độ kháng thể kháng nDNA [IgG và IgM] trong các mẫu thử.
Giá trị biện luận: Tốt nhất phải căn cứ vào các hướng dẫn biện luận và đơn vị tính đã được chuẩn hóa chất lượng của nhà sản xuất kít. Một trong những kít nDNA tốt và phổ biến trên thị trường có thông số biện luận như sau:
+ Ngưỡng bình thường: < 12 U/ml;
+ Ngưỡng nghi ngờ: từ 12 – 18 U/ml;
+ Ngưỡng dương tính: > 18 U/ml.
NHỮNG SAI SÓT VÀ XỬ TRÍ
Sai sót mẫu bệnh phẩm: tên bệnh nhân trên giấy chỉ định xét nghiệm và trên ống máu không thống nhất, máu bị đông;
Xử trí: yêu cầu nơi đưa mẫu xác minh lại thông tin giữa mẫu và giấy chỉ định, nếu cần phải lấy lại mẫu bệnh phẩm.
Sai sót do nhỏ mẫu vào phiến phản ứng không thống nhất thông tin về thứ tự bệnh nhân và thứ tự mẫu phân tích.
Xử trí: Vẽ sơ đồ nhỏ mẫu trước khi làm xét nghiệm. Kiểm tra đối chiếu thông tin vị trí nhỏ mẫu trước khi nhỏ mẫu.
Chứng dương âm tính hoặc chứng âm dương tính: Nếu xảy ra hiện tượng này đều không dùng được kết quả của lần xét nghiệm này. Nguyên nhân có thể do hóa chất không đảm bảo chất lượng, do không thực hiện đủ và đúng các bước trong quy trình xét nghiệm, nhiệt độ phản ứng không phù hợp, thực hiện bước rửa kém hiệu quả.
Xử trí: làm lại xét nghiệm, kiểm tra chỉ dùng hóa chất còn hạn sử dụng và được bảo quản đúng điều kiện theo hướng đãn của nhà sản xuất, tuân thủ đúng các bước quy trình, kiểm soát tốt nhiệt độ phòng xét nghiệm [25 - 30oC].
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Aesku Diagnostics GmbH. 2007. AESKULISA nDNA instruction manual.