Bao cao định lượng nitơ tổng bằng phương pháp Kjeldahl

Các phương pháp Dumas, phương pháp Biuret,  sử dụng tia UV,… là những phương tính hàm lượng nitơ rất hiệu quả. Tuy nhiên phương pháp được nhiều phòng thí nghiệm và viện nghiên cứu sử dụng phổ biến nhất hiện nay là phương pháp Kjeldahl. Bài viết này, Biogency sẽ xác định cách xác định các tính và đánh giá cách phân tích đạm của phương pháp Kjeldahl.

Phương pháp Kjeldahl là gì

Kjeldahl là phương pháp giúp xác định hàm lượng nitơ trong các hợp chất hữu cơ và vô cơ. Phương pháp được xem là tiêu chuẩn trên toàn thế giới để tính toán hàm lượng protein trong nhiều loại vật liệu khác nhau như nước thải, phân bón, từ thức ăn của người và động vật, hóa thạch,…

Từ năm 1883, phương pháp Kjeldahl được phát triển vào từ một nhà sản xuất bia tên là Johann Kjeldahl. Đây là một loại thực phẩm được tiêu hóa bằng axit mạnh để giải phóng nitơ, có thể được xác định bằng kỹ thuật chuẩn độ phù hợp.

Phương pháp này được rất nhiều tổ chức có tiếng công nhận như AOAC, ISO, USEPA, DIN, Pharmacopoeias.

Cách xác định hàm lượng nitơ bằng phương pháp Kjeldahl

Nguyên lý

Quá trình vô cơ hóa mẫu thử bằng H2SO4 và chất xúc tác, sau đó sử dụng chất kiềm mạnh như NaOH hay KOH để đẩy NH3 ra từ muối [NH4]2SO4 tạo ra thể tự do. Xác định hàm lượng NH3 bằng H2SO4 0,1N 

Cách tiến hành

– Đốt đạm: 

• Lấy 1g mẫu thử, 5g chất xúc tác K2SO4 và CuSO4 và 10ml dd  H2SO4 đậm đặc vào bình Kjeldahl

• Tiến hành đun chậm cho đến khi thu được dung dịch trong suốt không màu hay có màu xanh nhạt của CuSO4 khi để nguội.

Lưu ý: Quá trình vô cơ hóa mẫu thử trong bình Kjeldahl sẽ giải phóng khí SO2 vì thế phải tiến hành trong tử hút và trong quá trình đốt nên đặt ống nghiệm nằm hơi nghiêng.

– Chưng cất đạm: 

• Sau quá trình vô cơ hóa mẫu thử hoàn toàn, hãy cho một ít nước cất vào bình Kjeldahl để tráng rồi đưa vào bình định mức 500ml
• Tráng rửa sạch bình Kjeldahl và phễu nhiều lần rồi cho trực tiếp vào bình định mức 
• Cho khoảng 10-15ml NaOH 40% và vài giọt phenoltalein vào bình định mức
• Sau đó thêm nước cất vừa đủ 300ml vào bình

Chuẩn bị bình hứng NH3: sử dụng pipet cho vào bình hứng [chứa khoảng 10ml acid

Boric], sau đó lắp bình vào hệ thống làm sao cho đầu ống sinh hàn chứa đầy dung dịch acid Boric. Bắt đầu quá trình cất đạm đến khi dung dịch trong bình hứng đạt được 150ml.

– Chuẩn độ: Lấy bình hứng đem đi chuẩn độ bằng dung dịch H2SO4 0,1N.

Tính kết quả

Hàm lượng protein thô = [0,0014 x [VH2SO4 – V’H2SO4] x 100 x 6,25] / m

Với: 

+ 0,0014: lượng nitơ [g] tương đương với 1ml H2SO4 0.1N

+ V : dung dịch H2SO4 dùng cho mẫu trắng [ml]

+ V’ : dung dịch H2SO4 dùng cho mẫu thử [ml]

+ m: khối lượng của mẫu thử [g]

Đánh giá về phương pháp Kjeldahl

Ưu điểm phương pháp Kjeldahl

Phương pháp Kjeldahl được ứng dụng phổ biến và vẫn là phương pháp tiêu chuẩn để có thể so sánh với các phương pháp khác. Với độ chính xác rất cao và khả năng tái sản xuất rất tốt nên đây được xem là phương pháp chủ yếu để ước tính lượng protein trong thí nghiệm.

Nhược điểm phương pháp Kjeldahl

Khó để thước đo chính xác Nito vì tất cả nitơ không ở dạng protein. Với các loại protein khác nhau thì cần các yếu tố hiệu chỉnh khác nhau do trình tự axit amin khác nhau. Việc sử dụng axit sunfuric đậm đặc ở nhiệt độ cao sẽ ít nhiều gây ra một mối nguy hại đáng kể và chất xúc tác cũng vậy. Vì thế kỹ thuật này sẽ mất rất nhiều thời gian để có thể thực hiện.

____________________

 Kjeldahl là phương pháp hiệu quả nhất giúp xác định nồng độ hàm lượng và phần trăm nitơ tại các phòng thí nghiệm, trung tâm nghiên cứu. Mong rằng với những chia sẻ trên sẽ giúp bạn xác định hàm lượng nitơ một cách chính xác nhất trong các

Ngoài ra, để tìm hiểu nhiều hơn về các phương pháp xử lý nước thải bằng chế phẩm vi sinh xin hãy liên hệ ngay với chúng tôi theo số HOTLINE: 0909 538 514

Tài liệu tham khảo:

• //staff.agu.edu.vn/vttdao/files/2013/03/Th%E1%BB%B1c-h%C3%A0nh-PTTP.pdf 
• //thuvienkhoahoc.net/phuong-phap-kjeldahl-phan-tich-ham-luong-nito-chinh-xac-nhat.html
• BRADSTREET, Raymond B. Kjeldahl method for organic nitrogen. Analytical Chemistry, 1954, 26.1: 185-187.
• JONES JR, J. B., et al. Kjeldahl method for nitrogen determination. Kjeldahl method for nitrogen determination., 1991.
• KIRK, Paul L. Kjeldahl method for total nitrogen. Analytical chemistry, 1950, 22.2: 354-358.
• BREMNER, J. M. Determination of nitrogen in soil by the Kjeldahl method. The Journal of Agricultural Science, 1960, 55.1: 11-33.

Tóm tắt nội dung tài liệu

1. ĐỊNH LƯỢNG NITO TỔNG THEO PHƯƠNG PHÁP KJELDAHL CHƯNG CẤT ĐAM BẰNG BỘ CHƯNG CẤT KJELDAHL 1. NGUYÊN TẮC Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nito bị phân huỷ và oxy hoá đến CO2 và H2O còn nito chuyển thành amoniac [NH3] và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat Quá trình được thực hiện theo các bước sau: Bước 1: Vô cơ hoá nguyên liệu R-CH-COOH + H2SO4 t CO2+H2O+[NH4]2SO4 NH2 Xúc tác Bước 2: Cất đạm phản ứng xảy ra trong thiết bị cất đạm [NH4]2SO4 +2NaOH Na2SO4 +2NH3 +2H2O Phản ứng xảy ra trong bình hứng NH3 +H2SO4 [NH4]2SO4 +H2SO4 dư Bước 3: Chuẩn độ lượng H2SO4 còn thừa trong bình hứng bằng NaOH Ks.phanquangthoai Trang 1
2. D P2 C E B A F P1 BỘ CHƯNG CẤT ĐẠM KJELDAHL GIỚI THIỆU TERMAMYL -Termamyl là tên thị trường của enzyme amylase -Termamyl là một loại alpha-amylase ổn định nhiệt sản xuất bởi một chủng Licheniformis Bacillus. Ứng dụng: -Termamyl được sử dụng trong các ngành công nghiệp sau đây: Tinh bột Tinh bột là sản phẩm tự nhiên quan trọng nhất có nhiều ứng dụng trong kỹ thuật và trong đời sống con người. Nhiều nước trên thế giới sử dụng nguồn tinh bột từ khoai tây, lúa mì, ngô [sắn], còn riêng ở nước ta thì sử dụng gạo Ks.phanquangthoai Trang 2
3. và khoai mì là nguồn tinh bột chủ yếu. Trong chế biến tinh bột và đường, công đoạn quan trọng nhất là thuỷ phân tinh bột về các đường đơn giản. Sau đó, chủ yếu trên cơ sở đường đơn nhờ lên men, người ta sẽ nhận được rất nhiều sản phẩm quan trọng như: rượu cồn, rượu vang, bia, các loại acid hữu cơ, amino acid,…. Quá trình thuỷ phân tinh bột gồm hai công đoạn chủ yếu là giai đoạn hồ hoá và giai đoạn đường hoá. Để thực hiện hai công đoạn công nghệ nói trên, trong thực tế sản xuất người ta áp dụng hai cách: Thuỷ phân tinh bột bằng acid và bằng enzym. Để thuỷ phân tinh bột từ lâu người ta đã sử dụng acid vô cơ như HCl và H2SO4. Nhưng kết quả cho thấy, thuỷ phân bằng acid rất khó kiểm soát và thường tạo nhiều sản phẩm không mong muốn và không đáp ứng tiêu chuẩn an toàn thực phẩm. Do vậy, việc thay thế và ứng dụng enzym để thuỷ phân tinh bột là một kết quả tất yếu của lịch sử phát triển. Enzym amylase đã được tìm ra đã góp phần quan trọng cho nhiều ngành công nghiệp chế biến thực phẩm. Enzym amylase có thể tìm thấy ở nhiều nguồn khác nhau như amylase từ thực vật, động vật và VSV. Amylase càng ngày càng được thay thế acid trong sản xuất ở qui mô công nghiệp. Hiện nay, các nhà sản xuất có thể sử dụng amylase có khả năng chịu nhiệt cao mà không bị mất hoạt tính, chẳng hạn amylase được tách chiết từ VSV, cụ thể là các chủng vi khuẩn chịu nhiệt được phân lập từ những suối nước nóng. Ngoài ra, amylase còn có nhiều ưu điểm hơn khi sử dụng acid để thuỷ phân tinh bột: Năng lượng xúc tác thấp, không yêu cầu cao về thiết bị sử dụng, giảm chi phí cho quá trình tinh sạch dịch đường. Nguồn amylase có thể lấy từ mầm thóc, mầm đại mạch [ malt], hạt bắp nảy mầm, hay từ nấm mốc,… Nguyên liệu cho sản xuất là gạo, bắp, khoai mì,… đây là những nguồn nguyên liệu dễ tìm, rẻ tiền có thể tìm thấy dễ dàng ở nước ta. Do đó, đây là một lợi thế và là hướng phát triển mạnh làm cơ sở cho nhiều ngành khác phát triển. Ví dụ: sản xuất bánh kẹo, bia, cồn, sirô và làm mềm vải,… Trong công nghiệp tinh bột, Termamyl được sử dụng cho các hóa lỏng liên tục của tinh bột ở nhiệt độ lên tới 105-110 ° C, lợi dụng sự ổn định nhiệt cực độ của enzym này. Rượu Trong công nghiệp rượu, Termamyl được sử dụng cho tinh bột mỏng trong chưng cất mashes. Mía đường Trong công nghiệp đường, Termamyl được sử dụng để phá vỡ các mặt tinh bột trong nước trái cây mía. Qua đó nội dung tinh bột đường thô giảm và lọc tại nhà máy lọc tạo điều kiện. Ks.phanquangthoai Trang 3
4. Dệt may Trong ngành công nghiệp dệt may, Termamyl được sử dụng cho hàng dệt trước khi nhuộm ở nhiệt độ cao. HOẠT ĐỘNG -Enzyme termamyl là một endoamylase bẻ gãy mối liên kết hydrolyses 1,4- alpha glycosidic trong amylose và Amylopectin, hai thành phần của tinh bột. Do đó ,tinh bột bị phá vỡ nhanh chóng để tạo dextrins và oligosaccharides. -Termamyl hoạt động tối ưu ở pH 7 và 90 ° C. -Termamyl là một amylase được sử dụng để loại bỏ vết bẩn tinh bột . -Termamyl hiệu quả loại bỏ vết bẩn tinh bột và cung cấp độ trắng. Termamyl là có hiệu quả tại môi trường kiềm tương đối cao và ở nhiệt độ cao. Tổng quan về enzym amylase Amylase là gì? Amylase là một hệ enzyme rất phổ biến trong thế giới sinh vật . Các enzyme này thuộc nhóm enzyme thủy phân, xúc tác phân giải liên kết nội phân tử trong nhóm polysaccharide với sự tham gia của nước. Có 6 loại enzyme được xếp vào 2 nhóm: Endoamylase [ enzyme nội bào ] và exoamylase [ enzyme ngoại bào ]. Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh. Nhóm enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: Khử trực tiếp là Pullulanase [ hay α-dextrin 6 – glucosidase]; khử gián tiếp là Transglucosylase [hay oligo- 1,6-glucosidase] và maylo-1,6-glucosidase. Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide. Exoamylase gồm có β-amylase và γ-amylase. Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide. Cơ chất tác dụng của amylase là tinh bột và glycogen: • Tinh bột: là nhóm Carbohydrate ở thực vật, có chủ yếu trong các loại củ như khoai lang, khoai tây, khoai mì… , trong các hạt ngũ cốc, các loại hạt và có công thức tổng quát là [C6H12O6]n.Tinh bột từ mọi nguồn khác nhau đều có cấu tạo từ amylase và amylopectin [ Meyer, 1940 ]. Các loại tinh bột đều có 20-30% amylase và 70-80% amylopectin. Trong thực vật, tinh bột được xem là chất dự trữ năng lượng quan trọng. -Amylase có trọng lượng phân tử 50.000 – 160.000 Da, được cấu tạo từ 200- 1000 phân tử D-glucose nối với nhau bởi liên kết α-1,4-glucoside tạo thành một mạch xoắn dài không phân nhánh. Ks.phanquangthoai Trang 4
5. -Amylopectin có trọng lượng phân tử 400.000 đến hàng chục triệu Da, được cấu tạo từ 600-6000 phân tử D-glucose, nối với nhau bởi liên kết α-1,4- glucoside và α-1,6-glucoside tạo thành mạch có nhiều nhánh. Tinh bột không tan trong nước lạnh nhưng khi hỗn dịch tinh bột bị đun nóng [ 60- 850C ] thì tinh bột sẽ bị hồ hóa và được gọi là hồ tinh bột . Dưới tác dụng của enzyme amylase, tinh bột bị thủy phân do các liên kết glucoside bị phân cắt. Sự thủy phân tinh bột bởi enzyme amylase xảy ra theo 2 mức độ: Dịch hóa và đường hóa. Kết quả của sự dịch hóa là tạo ra sản phẩm trung gian dextrin và khi dextrin tiếp tục bị đường hóa thì sản phẩm là maltose và glucose. -Cabohydrate trong thực phẩm là nguồn cung cấp năng lượng quan trọng cho cơ thể con người. Rau và quả cũng là nguồn cung cấp tinh bột và tinh bột này một phần đã được chuyển hóa thành disaccharide và glucose. Carbohydrate có mặt trong hầu hết các loại thực phẩm nhưng nguồn cung cấp chủ yếu là đường và tinh bột. • Glycogen: là một loại Cabohydrate dự trữ. Ở động vật được dự trữ trong cơ thể động vật và được cơ thể chuyển hóa để sử dụng từ từ. Amylase có vai trò quan trọng trong sự chuyển hóa glucid ở tế bào động vật, VSV, glucogen được cấu tạo từ các glucose liên kết với nhau bởi liên kết α-1,4-glycoside ở các vị trí phân nhánh, glucose nối với nhau bằng liên kết α-1,6-glycoside. Glycogen có số mạch nhiều hơn tinh bột. Phân tử lượng ở trong khoảng 2 triệu-3 triệu Da. Glycogen dễ tan trong nước, nếu như chúng ta ăn quá nhiều Carbohydrate thì cơ thể chúng ta sẽ chuyển hóa chúng thành chất béo dự trữ. Ở động vật và người, glycogen tập trung chủ yếu ở trong gan. Đặc tính và cơ chế tác dụng của enzym α-amylas Đặc tính của enzym α-amylase α-amylase từ các nguồn khác nhau có thành phần amino acid khác nhau, mỗi loại α-amylase có một tổ hợp amino acid đặc hiệu riêng. α-amylase là một protein giàu tyrosine, tryptophan, acid glutamic và aspartic. Các glutamic acid và aspartic acid chiếm khoảng ¼ tổng lượng amino acid cấu thành nên phân tử enzyme: - α-amylase có ít methionine và có khoảng 7-10 gốc cysteine. - Trọng lượng phân tử của α-amylase nấm mốc: 45.000-50.000 Da [ Knir 1956;Fisher,Stein, 1960 ]. - Amylase dễ tan trong nước, trong dung dịch muối và rượu loãng. - Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline. -Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH=4,2-5,7 [ Bernfeld P, 1951 ]. -α-amylase là một metaloenzyme. Mỗi phân tử α-amylase đều có chứa 1-30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1-6 nguyên tử gam/mol Ca tham Ks.phanquangthoai Trang 5
6. gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc 3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme [ Modolova, 1965 ]. Do đó, Ca còn có vai trò duy trì sự tồn tại của enzyme khi bị tác động bởi các tác nhân gây biến tính và tác động của các enzyme phân giải protein. Nếu phân tử α-amylase bị loại bỏ hết Ca thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân cơ chất. α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác. Đặc tính này có lẽ liên quan đến hàm lượng Ca trong phân tử và nồng độ Mg2+. Tất cả các amylase đều bị kiềm hãm bởi các kim loại nặng như Cu2+, Ag+, Hg2+. Một số kim loại như :Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+, Co2+, Sn2+, Cr3+, không có ảnh hưởng mấy đến α-amylase. Thành phần amino acid của α-amylase ở nấm mốc Aspergillus như sau [ g/100 g protein ]: alamine=6,8 ; glycine= 6,6; valine= 6,9, leucine= 8,3; Isoleucine= 5,2; prolin= 4,2, phenylalanine= 4,2; tyrosine=9,5; trytophan= 4,0; xetin= 6,5; trionin= 10,7, cystein + cystine= 1,6; glutamic acid= 6,9; amide= 1,5 [ Akabori et amiloza, 1954 ]. Không giống các α-amylase khác, amylase của Asp.oryzae có chứa phần phi protein là polysaccharide. Polyose này bao gồm 8 mol maltose, 1 mol glucose, 2 mol hexozamin trên 1 mol enzyme [ Akabori et amiloza, 1965 ]. Vai trò của polyose này vẫn chưa rõ, song đã biết được rằng nó không tham gia vào thành phần của trung tâm hoạt động và nằm ở phía trong phân tử enzyme. α-amylase của nấm mốc hầu như chỉ tấn công những hạt tinh bột bị thương tổn. Sản phẩm cuối cùng của thủy phân amylase là glucose và maltose. Đối với nấm sợi tỉ lệ là 1:3,79 [ Hanrahan, Caldwell, 1953 ] .α-amylase của nấm sợi không tấn công liên kết α-1,6 glucoside của amylopectin, nên khi thủy phân nó sẽ tạo thành các dextrin tới hạn phân nhánh. Đây là một cấu trúc phân tử tinh bột do enzym α-amylase phân cắt tạo thành dextrin tới hạn phân nhánh. Sản phẩm thủy phân cuối cùng của tinh bột dưới tác dụng của amylase nấm sợi chủ yếu là maltose, thứ đến là maltotriose. Khi dùng nồng độ α-amylase VSV tương đối lớn có thể chuyển hóa 70-85% tinh bột thành đường lên men. Còn các α-amylase của nấm mốc thì mức độ đường hóa đến glucose và maltose có thể lên tới 84-87%. Điều kiện hoạt động của α-amylase từ các nguồn khác nhau thường không giống nhau. pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,0-4,8 [ có thể hoạt động tốt trong vùng pH từ 4,5-5,8 ]. Theo số liệu của Liphis, pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa và đường hóa của chế phẩm amylase từ Asp.oryzae trong vùng 5,6-6,2. Còn theo số liệu của Fenixova thì pH tối thích cho hoạt động dextrin hóa của nó là 6,0-7,0. Độ bền đối với tác dụng của acid cũng khác khác nhau. α-amylase của Ks.phanquangthoai Trang 6
7. Asp.oryzae bền vững đối với acid tốt hơn là α-amylase của malt và vi khuẩn Bac.subtilis. Ở pH= 3,6 và 0oC, α-amylase của malt bị vô hoạt hoàn toàn sau 15-30 phút; α-amylase vi khuẩn bị bất hoạt đến 50%, trong khi đó hoạt lực của α-amylase của nấm sợi hình như không giảm bao nhiêu [ Fenilxova, Rmoshinoi 1989 ]. Trong dung dịch α-amylase nấm sợi bảo quản tốt ở pH= 5,0-5,5; α-amylase dextrin hóa của nấm sợi đen có thể chịu được pH từ 2,5- 2,8.Ở 0oC và pH= 2,5, nó chỉ bị bất hoạt hoàn toàn sau 1 giờ. Nhiệt độ tối thích cho hoạt động xúc tác của α-amylase từ các nguồn khác nhau cũng không đồng nhất, α-amylase của nấm sợi rất nhạy cảm đối với tác động nhiệt. . Nhiệt độ tối thích của nó là 500C và bị vô hoạt ở 70OC[ Kozmina, 1991 ]. Trong dung dịch đệm pH= 4,7, α-amylase của Asp.oryzae rất nhạy với tác động của nhiệt độ cao, thậm chí ở 400C trong 3 giờ hoạt lực dextrin hóa của nó chỉ còn 22-29%, hoạt lực đường hóa còn 27-85%. Ở 500C trong 2 giờ, α- amylase của nấm sợi này bị vô hoạt hoàn toàn [ Miller và cộng sự ]. Cơ chế tác dụng của enzym α-amylase α-amylase [ 1,4-α-glucan-glucanhydrolase ]. α-amylase từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau. α-amylase có khả năng phân cách các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phần tử cơ chất [ tinh bột hoặc glycogen ] một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả. α-amylase không chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên song với tốc đột rất chậm. Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình đa giai đoạn. + Ở giai đoạn đầu [ giai đoạn dextrin hóa ]:Chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp [α-dextrin ], độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh [ các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh ]. + Sang giai đoạn 2 [ giai đoạn đường hóa ]: Các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine. Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide. Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6-7 gốc glucose[ vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6-7 gốc glucopiranose 1 ]. + Sau đó, các poliglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose và maltotriose và maltose. Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân Ks.phanquangthoai Trang 7
8. của amylose chứa 13% glucose và 87% maltose. Tác dụng của α-amylase lên amylopectin cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên [ 72% maltose và 19% glucose ] còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%. Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp. Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với Iodine và một ít maltose. Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó. Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa. Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của α-amylase: + Giai đoạn dextrin hóa: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp + Giai đoạn đường hóa: Dextrin tetra và trimaltose di & monosaccharide Amylase oligosacharide poliglucose Maltose maltotriose maltotetrose 2.NGUYÊN LIỆU, HOÁ CHẤT , THIẾT BỊ: NGUYÊN LIỆU: Mẫu termamyl đã vô cơ hoá và pha loãng HOÁ CHẤT : H2SO4 N/100 NaOH N/100 Metyl đỏ CÁCH TIẾN HÀNH: Bước 1: Vô cơ hoá mẫu _ termamyl dùng đã được vô cơ hoá mẫu sẵn. Bước 2 : Cất đạm a ]Rửa máy : - Đun sôi bình A và mở nước vào ớng làm lạnh F. Khoá P1 và P2 đều đóng , sau đó cho vào phễu D ít nước cất [khoảng 10ml] và cho chảy xuống bình C bằng P2. Hơi nước của bình A sẽ từ từ qua erlen F, cứ để như vậy cho đến khi erlen F có khoảng 5ml nước thì ngưng đun bình A, làm nguội bình A , áp suất trong bình A giảm xuống đồng thời áp suất trong bình B cũng giảm , do đó nước trong bìnhC sẽ rút qua B . Ks.phanquangthoai Trang 8
9. - Khi nước đã rút hết ta lại thêm nước vào phễu D, và lại mở kẹp cho nước chảy qua C, kế đó nước sẽ rút qua B. Ta làm như vậy chừng vài lần. - Nuớc ở bình B đầy ta mở kẹp P1 cho nước chảy ra. Khoá kẹp P1 và P2 lại. b]Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3 [bình F]: Cho vào bình hứng F [erlen 250 ml] 15ml H2SO4 N/100 và 5 giọt thuốc thử metyl đỏ, dung dịc có màu tím đỏ. Đặt bình hứng sao cho đầu mút của ống sinh hàn E ngập trong dung dịch của bình hứng. c]Thực hiện chung cất lôi cuốn hơi nước: - Lúc này bình A đang được đun sôi, kẹp P1 v à P2 đóng. Đổ vào phễu D 10 ml dung dịch termamyl, mở kẹp P2 sao cho dung dịch chảy từ từ xuống bình C, đóng P2 lại. Đổ nước tráng vào D và mở kẹp cho nước chảy từ từ xuống C cho đến khi mực nước trong D xuống gần sát kẹp P2 thì khoá kẹp P2 lại. Sau đó tráng D bằng nước cất vài lần với thao tác như trên. - Thêm vào phễu D 10 ml NaOH đậm đặc . Mở khoá P2 từ từ để cho NaOH chảy từ từ xuống C từng giọt một. Nếu nước trong C trào lên mạnh quá thì khoá P2 lại, rồi sau đó lại tiếp tục cho NaOH chảy gần hết xuống C. Tráng phễu D 2 lần bằng nước cất , chỉ cho nuớc chảy gần sát tới P2 mà thôi. - Tiếp tục chưng cất lôi cuốn hơi nước trong 5 phút, sau đó hạ erlen xuống sao cho đầu mút của ống sinh hàn trong không khí , đun tiếp 3 phút. Rửa đầu mút của sinh hàn E nằm trong không khí, đun tiếp 3 phút nữa. Rửa đầu mút lại bằng nước cất, rồi lấy erlen ra để định lượng H2SO4 thừa. - Ngưng đun bình A , rửa máy vài lần. *Ta thực hiện lại một lần thử không thay vì dùng termamyl ta dùng 10 ml nước cất. Bước 3: Chuẩn độ Lượng H2SO4 N/100 còn thừa trong bình F được chuẩn độ bằng NaOH N/100. Quá trình chuẩn độ kết thúc khi dung dịch chuyển từ đỏ tím sang màu vàng nhạt. 3.SƠ ĐỒ KHỐI Ks.phanquangthoai Trang 9
10. RỬA MÁY CHƯNG CẤT ĐẠM 2 ĐẾN 3 LẦN CHUẨN BỊ DUNG DỊCH Ở BÌNH HỨNG F : 15 ml dung dich H2SO4 VÔ CƠ HOÁ MẪU N/100, 5 giọt metyl đỏ TERMAMYL ĐUN SÔI BÌNH A CHO VÀO PHỄU D, TRÁNG LẠI MẪU TERMAMYL PHỄU BẰNG NƯỚC CẤT 10 ML CHO 10 ml DUNG DỊCH NaOH , TRÁNG LẠI BẰNG NƯƠC CẤT NaOH N/100 -CHƯNG CẤT LÔI CUỐN HƠI NƯỚC TRONG 5 PHÚT -SAU ĐÓ HẠ ERLEN XUỐNG SAO CHO ĐẦU MÚT CỦA ỐNG SINH HÀN TRONG KHÔNG KHÍ , ĐUN TIẾP 3 PHÚT. -RỬA ĐẦU MÚT CỦA SINH HÀN E NẰM TRONG KHÔNG KHÍ, ĐUN TIẾP 3 PHÚT NỮA. -RỬA ĐẦU MÚT LẠI BẰNG NƯỚC CẤT LẤY DUNG DỊCH TRONG BÌNH F CHUẨN ĐỘ VỚI NaOH N/100 ĐẾN KHI DUNG DỊCH CHUYỂN SANG VÀNG NHẠT XÁC ĐỊNH HỆ SỐ HIỆU CHUẨN : Lấy 2 erlen , cho vào mỗi erlen 20 ml H2SO4 N/100 và vài giọt metyl đỏ . Sau đó chuẩn độ bằng dung dịch NaOH N/100 . Ks.phanquangthoai Trang 10
11. 4. KẾT QUẢ Thể tích NaOH N/100 [ml] Mẫu trắng [V0] 12.8 Mẫu chuẩn [ V1] 7.9 Xác định hệ số hiệu chỉnh [lần 1] [V 16.8 NaOH1] Xác định hệ số hiệu chỉnh [lần 2] [V 17 NaOH2] a] Hệ số hiệu chuẩn V NaOH1 = 16,8 ml V NaOH2 = 17,0 ml vậy V NaOH = 16,9 ml Hệ số hiệu chuẩn 20 ml NaOH N / 100 20 X    1.1834 V NaOH N / 100 16.9 b] Tính lượng đạm có trong mẫu Gọi Vo là thể tích NaOH của lần thử không , Vo=12,8ml V1 là thể tích NaOH của lần thử thât , V1=7,9 ml Lượng NaOH tương ứng với NH3 phóng thích bởi 10 ml dung dịch termamyl đã vô cơ hoá và pha loãng ▲V=V0-V1 = 12.8 – 7.9 =4.9 Số mol NH3 phóng thích tương đương với số mol NaOH. Do đó , số mol NH3 phóng thích bởi 10ml dung dịch termamyl là : Ks.phanquangthoai Trang 11
12. V . X  V . X .10 5  4.9  1.1834  10 5  5.798  10 5 [ mol ] 100.1000 Số gram đạm có trong 10ml dung dich termamyl đã vô cơ hoá và pha loãng là: 14.∆V.X.10-5 =14*5.798*10-5 =8.118*10-4 [g] Số gram đạm có trong 100ml dung dịch đạm vô cơ hoá là 100 14.V . X .10 5.  14.V . X .10 4  8.118  10  3 [ g ] 10 Số gram đạm có trong 1 lit mẫu ban đầu 1000 1000 14.V . X .10 4.  14 * 4.9 * 1.1834 *  8.118 [ g / l ] Vm 1 5.NHẬN XÉT Phương pháp cho kết quả khá chính xác, thực hiện khá đơn giản, sai số không cao. Lượng đạm có trong mẫu termamyl tương đối thấp. Ks.phanquangthoai Trang 12
13. 6. MỞ RỘNG Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldahl BỘ CHƯNG CẤT KJELDAHL LỚN [1849-1900], nhà hoá học người Đan Mạch Định lượng nitơ tổng số theo phương pháp Microkjeldahl 1. Nguyên tắc: Trong phân tử protein, hàm lượng nitơ chiếm tỉ lệ 15- 18% khối lượng phân tử. Do đó nếu xác định được hàm lượng % nitơ trong nguyên liệu, tùy theo mỗi loại protein mà ta nhân với hệ số khác nhau. Hàm lượng protein động vật: % protein = % N protein x 6,25 Hàm lượng protein thực vật: % protein = % N protein x 6,25 đối với hạt ngũ cốc. % protein = % N protein x 5,75 đối với hạt đậu đỏ. Dưới tác dụng của H2SO4 đặc, nhiệt độ cao nitơ có trong thành phần các hợp chất hữu cơ tạo thành [NH4]2 SO4. Dùng kiềm đặc, đầy nitơ ra khỏi muối của nó dưới dạng NH3 kết hợp với hơi nước tạo thành NH4OH. Lượng nitơ có trong thành phần NH4OH được xác định bằng hệ chuẩn H2SO4- NaOH hoặc H3BO3- H2SO4 0,01N. 2. Hóa chất và nguyên liệu: Ks.phanquangthoai Trang 13
14. Thuốc thử hỗn hợp: xanh metylen 0,1% và đỏ metylen 0,1% trong ethanol 960 với tỉ lệ ½; H2SO4 đặc; hỗn hợp xúc tác K2SO4/ CuSO4 với tỉ lệ 3/1; H2SO4 0,01N; NaOH 0,01N; H3BO3 2%; ethanol 960; axit trichloacetic 20%. Các nguyên liệu có nguồn gốc động vật như thịt, cá, nguồn gốc thực vật như gạo, ngô, đậu đỗ, sấy khô tuyệt đối ở 1050C 3. Dụng cụ: Ống đong 100ml, 50ml, 10ml; bình định mức 100ml [3]; cốc 250ml, 100ml, 50ml[3], đũa thủy tinh [3]; lọ đựng hóa chất[7]; máy Microkjeldahl bán tự động hoặc tự động; bếp đun; ống sinh hàn 4. Tiến hành: Cân 200mg nguyên liệu dạng bột sấy khô tuyệt đối cho vào bình kjeldahl, dùng ống đong 10ml H2SO4 đặc đổ vào bình kjeldahl sẽ thấy xuất hiện màu nâu đen do nguyên liệu đã bị oxy hóa. Cho thêm 200mg hỗn hợp xúc tác, lắc nhẹ, đậy kín bình, để một thời gian cho H2SO4 tác dụng với nguyên liệu sẽ giảm bớt được thời gian đun. Sau đó đặt bình kjeldahl lên bếp đun [đặt hơi nghiêng], đậy miệng bình bằng phễu thủy tinh, đặt bếp vào trong phòng hút khí. Khi đã sôi, giữ nhiệt độ bếp đun không quá cao để tránh hóa chất trào ra, vừa tránh mất amoniac. Trong khi đun theo dõi sự mất màu đen của dung dịch trong bình đun, khi thấy dung dịch có màu trong suốt thì có thể lắc nhẹ bình để kéo hết các phân tử ở trên thành bình chưa bị oxy hóa vào trong dung dịch. Tiếp tục đun cho đến khi dung dịch trong hoàn toàn. Để nguội bình, chuyển dung dịch sang bình định mức 100ml, dùng nước cất tráng lại bình kjeldahl và dẫn tới vạch. - Giai đoạn cất đạm theo phương pháp dùng hệ chuẩn H2SO4- NaOH: Cho nước cất 1 lần tới 2/3 thể tích của bình, cắm điện đun sôi nước trong bình. Hơi nước và nhiệt độ của bình 1 giúp cho nitơ trong [NH4]2 SO4 của dịch nghiên cứu bị NaOH 30% đẩy ra dưới dạng NH3. NH3 được ngưng tụ Ks.phanquangthoai Trang 14
15. nhờ hệ thống làm lạnh và hơi nước tạo thành NH4OH. Sau khi nước trong bình đã sôi, cho vào bình hứng 10ml H2SO4 0,01N và 3 giọt thuốc thử hỗn hợp, dung dịch trong bình nón sẽ có màu tím hồng chứng tỏ môi trường axit. Đặt bình hứng vào giá đỡ sao cho đầu mút của ống sinh hàn ngập trong dung dịch của bình hứng. Nếu lương axit trong bình hứng không đủ ngập, có thể cho thêm vào một ít nước cất vô đạm. Máy Microkjendahl Các bộ phận của máy: 1. Bình đun 2. Bình cất 3. Hệ thống sinh hàn 4. Bình hứng 5. Bình đựng dung dịch thải Ks.phanquangthoai Trang 15
16. Cho vào bình cất 10ml dung dịch nghiên cứu và 3 giọt thuốc thử hỗn hợp, sau đó tráng phễu bằng nước cất vô đạm. Cho tiếp vào bình cất 15ml NaOH 30% rồi đóng chặt van lại. Dung dịch trong bình cất chuyển từ màu tím hống sang màu xanh lá mạ thể hiện môi trường kiềm. Sau 8-10 phút cất đạm, để kiểm tra xem NH4OH còn được tạo ra không, dùng giấy quỳ thử dung dịch ở đầu ống sinh hàn. Nếu giấy quỳ còn màu xanh thì phải cất đạm tiếp, nếu giấy quỳ không đổi màu thì quá trình cất đạm đã xong, lấy bình hứng đem chuẩn độ. - Chuẩn độ: Dùng NaOH 0,01N chuẩn độ cho tới khi dung dịch trong bình hứng chuyển từ màu tím hồng sang màu xanh lá mạ. Lượng NaOH 0,01N dùng để chuẩn độ bằng H2SO4 0,01N còn dư trong bình hứng. - Tính kết quả: Hàm lượng % nitơ tổng số hay nitơ toàn phần được tính theo công thức N% = 1,42 x[ V1 – V2] x 100 / a V1: Số ml H2SO4 0,01N cho vào bình hứng. V2: Số ml NaOH 0,01N đã chuẩn độ. [ V1 – V2]: Số ml H2SO4 0,01N trong bình hứng đã bị trung hòa bởi NH4OH được tạo ra do quá trình chưng cất đạm 1,42 là hệ số: cứ 1ml H2SO4 0,01N dùng để trung hòa NH4OH thì tương đương với 1,42 mg nitơ. a là số nguyên liệu tính bằng gam của mẫu cất đạm Sau khi tính được nitơ tổng số, đem kết quả đó nhân với hệ số tương ứng sẽ cho ra hàm lượng protein trong nguyên liệu.. Ks.phanquangthoai Trang 16
17. XÁC ĐỊNH NITO TỔNG VỚI MẪU MÌ TIỂU NHỊ BẰNG MÁY KJELDAHL TỰ ĐỘNG 1. NGUYÊN TẮC Trước tiên mẫu được vô cơ hoá bằng H2SO4 đậm đăc ở nhiệt đọ cao và có chất xúc tác . Các phản ứng của quá trình vô cơ hoá xảy ra như sau: 2 H2SO4 2H2O +2SO2 +O2 Oxy tạo thành lại oxy hoá các nguyên tố khác : cacbon tạo thành CO2, hydro tạo thành H2O , còn nito giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành [NH4]2SO4 tan trong dung dịch. NH3 + H2SO4 [NH4]2SO4 QUÁ TRÌNH CHƯNG CẤT ĐẠM BẰNG HỆ THỐNG TỰ ĐỘNG Chất đạm đã được vô cơ hoá nằm dưới dạng amoni sulfat khi có tác dụng với chất kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng thích ra amoniac. [NH4]2SO4 +2NaOH Na2SO4 +H2O +2NH3 Sau đó , NH3 được hơi nước lôi cuốn và đưa vào dung dịch H3BO3. Trong dung dịch này, NH3 tồn tại dưới dạng ion NH4+ và giải phóng ra ion H2BO3- Chuẩn độ lượng ion nàu bằng HCl chuẩn sẽ xác định được lượng amoniac sinh ra. Từ đó, suy ra được lượng đạm trong mẫu nguyên liệu ban đầu. CÁC THIẾT BỊ TỰ ĐỘNG CHƯNG CẤT KJELDAHL Ks.phanquangthoai Trang 17
18. THIẾT BỊ VÔ CƠ THIẾT BỊ CHƯNG HOÁ MẪU CẤT ĐẠM 2.THIẾT BỊ VÀ DỤNG CỤ Bộ chưng cất đạm Kjeldahl tự động Erlen 250 ml Burret 25 ml 3. HOÁ CHẤT Dung dịch H2SO4 đậm đặc Dung dịch NaOH 40% Hỗn hợp xúc tác K2SO4 và CuSO4 [tỉ lệ 3:1] Dung dịch H3BO3% Thuốc thử hỗn hợp metyl đỏ 0.1 % pha trong cồn 4.CÁCH TIẾN HÀNH - Vô cơ hoá mẫu : cho 5 [g] mì tiểu nhị vào ống Kjeldahl , thêm vào 5ml dung dịch H2SO4 đậm đặc và hỗn hợp xúc tác K2SO4 và CuSO4. Đưa ống vào máy để vô cơ hoá mẫu. - Dịnh đạm bằng máy Kjeldahl : Ks.phanquangthoai Trang 18
19. Mẫu sau khi vô cơ hoá được đưa vào máy Kjeldahl để định đạm. Đồng thời , đưa vào một erlen có chứa thuốc metyl đỏ để thu mẫu . Mẫu này sau đó đem đi chuẩn độ bằng dung dịch HCl 0.1 N đến khi xuất hiện màu hồng nhạt. SƠ ĐỒ KHỐI 5g MÌ TIỂU NHỊ DUNG DỊCH H2SO4 HỖN HỢP K2SO4 VÀ CuSO4 VÔ CƠ HOÁ MẪU ĐỊNH ĐẠM BẰNG MÁY KJELDAHL TỰ ĐỘNG ERLEN CHỨA THU MẪU METYL ĐỎ CHUẨN ĐỘ MẪU BẰNG DUNG DỊCH HCl 0.1 N KẾT QUẢ thể tích HCl 0.1 N [ml] Mẫu trắng 0.01 Mẫu thật 5.2 Hàm lượng Nito tổng số [ Nt] trong nguyên liệu là: Ks.phanquangthoai Trang 19
20. [V1  Vt ]  0.00141000 [5.2  0.01]  0.0014*1000 Nt    7.266[ g / l ] V 1 V1: thể tích HCl 0.1 N chuẩn độ mẫu thật Vt: thể tích HCl 0.1 N chuẩn độ mẫu trắng V:thể tích dịch mẫu lấy ban đầu 0.0014 : số gram nito ứng với 1ml HCl 0.1N 6.NHẬN XÉT Lượng nitơ có trong mẫu ban đầu khá cao. Phương pháp này khá chính xác và đơn giản. 7.MỞ RỘNG Ngoài ra còn có một số máy chưng cất tự động Kjeldahl được thiết kế khác Ks.phanquangthoai Trang 20

Page 2

YOMEDIA

Dưới tác dụng của H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao, các hợp chất có chứa nito bị phân huỷ và oxy hoá đến CO2 và H2O còn nito chuyển thành amoniac [NH3] và tiếp tục kết hợp với H2SO4 tạo thành muối amoni sulfat

07-10-2013 1768 156

Download

Giấy phép Mạng Xã Hội số: 670/GP-BTTTT cấp ngày 30/11/2015 Copyright © 2009-2019 TaiLieu.VN. All rights reserved.