Link tải luận văn miễn phí cho ae 1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp có độ nhạy cao, có thể xác định tới 1g, hoá chất đơn giản ít tốn thời gian. Một ưu điểm lớn của phương pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất là amoniumsufate. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế [Spectrophotometer] ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl [ODo]. Lấy giá trị OD = ODX – ODO. Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành. Hóa chất Dung dịch albumine 0.1%. Nước cất Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử trong 100 ml như sauo Coomassie Brilliant Blue: 0.001g.o Ethanol tuyệt đối: 4.7 g.o Phosphoric acid: 85%.
Xem link download tại Blog Kết nối!
Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục 1.1. Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford Trong các phương pháp xác định hàm lượng protein thì đây là phương pháp có độ nhạy cao, có thể xác định tới 1g, hoá chất đơn giản ít tốn thời gian. Một ưu điểm lớn của phương pháp này là ít bị cản trở bởi các hoá chất sử dụng trong nghiên cứu protein, nhất là amoniumsufate. Nguyên tắc: Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước sống thấp thu cực đại là 465 nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển sang dạng màu xanh dương và hấp thu cực đại ở mức cực đại ở bước sóng 595 nm. Độ hấp thu ở bước sóng 596 nm có liên hệ một cách trực tiếp với nồng độ protein. Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ. Sau khi cho dung dịch protein vào thuốc nhuộm màu, màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy quang phổ kế [Spectrophotometer] ta được ODx, độ hấp thụ sẽ tỷ lệ với lượng protein trong mẫu. Thực hiện một đối chứng với HCl [ODo]. Lấy giá trị OD = ODX – ODO. Lượng protein trong mẫu dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành. Hóa chất Dung dịch albumine 0.1%. Nước cất Dung dịch thuốc thử Bradford: thành phần thuốc thử trong 100 ml như sau o Coomassie Brilliant Blue: 0.001g. o Ethanol tuyệt đối: 4.7 g. o Phosphoric acid: 85%. Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được hoà tan trong ethnol trong một chai đựng màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid và chỉnh tới 100 ml bằng nước cất. Lắc đều và giữ lạnh dưới 4oC. Dựng đường chuẩn albumine Pha loãng dung dịch albumine thành các nồng độ khác nhau: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 g/ml. Bảng 3.1. Dựng đường chuẩn albumine Ống nghiệm Đối 1 2 3 4 5 6 7 8 9 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2 chứng Nồng độ [g/ml] Dung dịch albumin chuẩn [l] Nước cất [l] Thuốc thử Bradford [ml] Ống số 0 tương ứng với ống đối chứng chứa nước cất. Tất cả các ống sau khi pha đúng nồng độ, để khoảng 20 phút. Tiến hành đo mật độ quang của dung dịch ở bước sóng 595 nm. Dựng đường chuẩn. Định lượng protein trong mẫu thí nghiệm Lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2 ml thuốc thử Bradford. Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595 nm. Từ đó suy ra hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm. Mẫu được pha loãng sao cho mật độ quang đo được trong khoảng đường chuẩn. Kết quả tính toán: Từ phương trình đường chuẩn và mật độ quang của mẫu khoả sát ta suy ra hàm lượng protein của mẫu là X [g/ml] có trong m [g] nguyên liệu. Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục Vậy lượng protein có trong 1 gam nguyên liệu là: Hàm lượng protein [mg/g] = X 1000. m Hình 3.2. Đường chuẩn albumine Chương 2 Xác định hoạt tính enzyme protease bằng phương pháp Amano Nguyên tắc: Dùng protein “casein” làm cơ chất xúc tác định hoạt tính phân giải protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng Tyrosin tương ứng với lượng sản phẩm thuỷ phân dưới tác dụng của enzyme. Hoá chất: HCL 0.1 M Ma2CO3 0.4 M Dung dịch Trichloracetic 0.4 M Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục Tyrosin tinh khiết NaOH 0.1 M Thuốc thử Folin H3PO4 1/30 M Đệm phosphate [pH 7] 0.1 M Dụng cụ và thiết bị Ống nghiệm, pipette, bình định mức, giấy lọc. Bể ổn nhiệt Máy đo quang phổ UV – Vis Máy đo pH Xây dựng đường chuẩn tyrosine Bảng 3.2. Đường chuẩn tyrosine Ống số Đối 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 20 30 40 50 60 70 80 90 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 Dung dịch HCl [l] 1000 990 980 970 960 950 940 930 920 910 Na2CO3 [ml] 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Nồng độ [g/ml] Dung dịch tyrosine chuẩn [l] Thuốc thử Folin [ml] chứng 0 Pha dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 gtyrosine / mlHCl như bảng 3.3.2. Thêm 5 ml dung dịch Na 2CO3 0,4M vào dung dịch tyrosine ở các nồng độ khác nhau ở trên và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi trộn đều, để ổn định dung dịch ở 37 0,50C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở bước sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90. As100 Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục Đối với ống đối chứng dùng 1 ml acid HCl 0,1M thay cho tyrosine. Đo độ hấp thu của dung dịch này ở bước sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là Aso. Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối chứng sẽ được giá trị OD1 đến OD9. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo nồng độ protein. Đồ thị này gọi là đường chuẩn tyrosine. Xác định hoạt tính enzyme protease Hoạt tính enzyme được khảo sát ở nhiệt độ 370C và pH = 7. Cho 1 ml dung dịch cơ chất casein 1% vào ống nghiệm, ủ ở 37 0,50C trong 10 – 15 phút. Sau thời gian ủ, cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào và lắc đều. Đem ủ hỗn hợp này ở 37 0,50C trong một giờ. Cho vào 2 ml dung dịch TCA 0,4M để ngừng phản ứng enzyme. Để ổn định dung dịch trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa. Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 vào 1ml dịch lọc. Thêm 1 ml thuốc thử Folin. Trộn đều, để yên ở 37 0,50C trong 20 phút. Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thu ở bước sóng 660 nm [ghi nhận kết quả này là Am]. Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml dung dịch enzyme và tiến hành các bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ là A0. Hàm lượng tyrosine được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng cách lấy Am – A0 rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt tínhprotease theo tính toán sau : Một đơn vị hoạt tính [ĐVHT] enzyme protease được xác định là lượng enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 g tyrosine trong 1 ml dịch lọc dưới điều kiện thí nghiệm. Ký hiệu là: U Hoạt tính enzyme protease [ĐVHT/ml] = [Am – A0].F.1/100.n Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục [Am – A0].F.1/100.n.V m F = [10/ As10 + 20/ As20 + 30/ As30 + 40/ As40 + 50/ As50 + 60/ As60 Hoạt tính enzyme protease [ĐVHT/g] = + 70/ As70 + 80/ As80 + 90/ As90+100/As100]/10 Am : độ hấp thu của mẫu A0 : Độ hấp thu của ống đối chứng F : Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thu ở bước sóng 660 nm trên đường chuẩn. n : Hệ số pha loãng của enzyme 1/100 : Hệ số chuyển đổi V : Thể tích của dung dịch enzyme m : khối lượng chế phẩm enzyme thô. Tính toán hoạt tính riêng [HTR] của enzyme protease: từ kết quả hàm lượng protein [mg/ml] và hoạt tính enzyme protease [U/ml] tính hoạt tính riêng của enzyme. HTR [U/mg] = Số đơn vị hoạt tính mg protein enzyme Ket-noi.com diễn đàn công nghệ, giáo dục Đường chuẩn tyrosine
Các sự khác biệt chính giữa xét nghiệm bradford và lowry protein là Xét nghiệm protein Bradford dựa trên sự thay đổi độ hấp thụ của thuốc nhuộm Coomassie màu xanh lam rực rỡ G-250 trong khi xét nghiệm protein Lowry dựa trên phản ứng của các ion đồng [Cu +] được tạo ra bởi quá trình oxy hóa các liên kết peptit với thuốc thử Folin – Ciocalteu.
Xét nghiệm là một kỹ thuật phân tích giúp xác định các thành phần chức năng chính của mẫu. Do đó, một thử nghiệm có thể là một thử nghiệm định tính hoặc định lượng. Nhiều lĩnh vực bao gồm y học phòng thí nghiệm, dược học, sinh học môi trường, sinh học phân tử, hóa sinh và miễn dịch học sử dụng loại xét nghiệm này thường xuyên. Xét nghiệm protein Bradford và Lowry là hai xét nghiệm sinh hóa xác định nồng độ protein trong dung dịch mẫu. Cả hai thử nghiệm đều sử dụng kỹ thuật so màu để cung cấp kết quả.
1. Tổng quan và sự khác biệt chính 2. Xét nghiệm Protein Bradford là gì 3. Xét nghiệm Protein Lowry là gì 4. Điểm giống nhau giữa xét nghiệm Bradford và Lowry Protein 5. So sánh song song - Thử nghiệm protein Bradford vs Lowry ở dạng bảng
6. Tóm tắt
Xét nghiệm protein Bradford là một quy trình phân tích quang phổ nhanh để phân tích protein. Nó cho thấy độ chính xác cao khi đo nồng độ protein trong dung dịch. Marion Bradford đã giới thiệu quy trình này vào năm 1976. Trong thử nghiệm này, tổng phản ứng dựa trên thành phần axit amin của các protein được đo. Nói cách khác, xét nghiệm protein Bradford là một xét nghiệm so màu. Nó sử dụng màu nhuộm Coomassie màu xanh lam rực rỡ. Do đó, xét nghiệm protein so màu này phụ thuộc vào sự thay đổi độ hấp thụ của thuốc nhuộm. Coomassie màu xanh lam rực rỡ G-250 tồn tại ở ba định dạng: cation [đỏ], anion [xanh lam] và trung tính [xanh lục]. Trong điều kiện có tính axit, màu đỏ của thuốc nhuộm chuyển thành màu xanh lam. Nó xác nhận sự liên kết của protein. Nếu không có protein, dung dịch có thể vẫn có màu nâu.
Xét nghiệm protein Bradford khác với các xét nghiệm protein khác vì nó ít bị ảnh hưởng bởi các hợp chất hóa học khác nhau có trong dung dịch protein. Các hợp chất này bao gồm natri, kali, glucose và sucrose, v.v.
Xét nghiệm protein thấp là một xét nghiệm sinh hóa được sử dụng để xác định mức tổng số của protein trong dung dịch. Oliver H. Lowry là người đã phát triển thuốc thử này vào năm 1940. Quy trình mô tả tổng nồng độ protein của dung dịch bằng sự thay đổi màu sắc tỷ lệ với nồng độ protein trong dung dịch. Do đó, đây cũng là một xét nghiệm protein đo màu.
Phản ứng giữa các ion đồng [Cu +] được tạo ra bởi quá trình oxy hóa các liên kết peptit và thuốc thử Folin – Ciocalteu là cơ sở của quy trình này. Ngoài ra, thuốc thử này còn chứa axit phosphomolybdic và axit phosphor-tungstic. Tuy nhiên, cơ chế phản ứng của xét nghiệm Lowry protein vẫn chưa được hiểu rõ. Nhưng nó liên quan đến quá trình oxy hóa dư lượng cysteine, tryptophan và tyrosine bằng cách khử thuốc thử Folin – Ciocalteu.
Dư lượng cysteine góp phần vào độ hấp thụ được quan sát thấy trong xét nghiệm protein Lowry và kết quả phản ứng tạo ra phân tử màu xanh lam rực rỡ; màu xanh lam molypden heteropoly. Sự khử của phân tử này được đo bằng độ hấp thụ ở bước sóng 660nm. Do đó, nồng độ của dư lượng cysteine và tryptophan đã làm giảm thuốc thử Folin – Ciocalteu suy ra tổng nồng độ của protein trong dung dịch.
- Các xét nghiệm protein Bradford và Lowry xác định nồng độ protein trong dung dịch.
- Cả hai phương pháp đều là phương pháp đo màu.
- Ngoài ra, độ nhạy của cả hai phương pháp đều cao.
Xét nghiệm protein Bradford và Lowry là hai loại xét nghiệm xác định nồng độ protein trong dung dịch. Xét nghiệm protein Bradford dựa vào sự thay đổi độ hấp thụ của thuốc nhuộm Coomassie màu xanh lam rực rỡ G-250 trong khi xét nghiệm protein Lowry phụ thuộc vào phản ứng của các ion đồng được tạo ra bởi quá trình oxy hóa các liên kết peptit, với thuốc thử Folin – Ciocalteu. Vì vậy, đây là điểm khác biệt chính giữa xét nghiệm protein Bradford và Lowry. Xét nghiệm protein Bradford mất 15 phút để đưa ra kết quả trong khi xét nghiệm protein Lowery mất 40-60 phút để đưa ra kết quả. Do đó, đây là một điểm khác biệt giữa xét nghiệm protein Bradford và Lowry. Hơn nữa, xét nghiệm protein Bradford phụ thuộc vào thành phần axit amin trong khi xét nghiệm protein Lowry phụ thuộc một phần vào thành phần axit amin. Do đó, đây cũng là sự khác biệt giữa xét nghiệm protein Bradford và Lowry.
Dưới đây inforaphic cung cấp thêm chi tiết về sự khác biệt giữa xét nghiệm protein Bradford và Lowry.
Tóm tắt - Thử nghiệm Bradford vs Lowry Protein
Xét nghiệm là một kỹ thuật phân tích được sử dụng để xác định đặc điểm của thành phần chức năng chính của mẫu. Xét nghiệm protein Bradford và Lowry là hai loại xét nghiệm protein hoạt động theo kỹ thuật so màu. Cả hai xét nghiệm protein Bradford và Lowry đều xác định nồng độ protein trong dung dịch. Tuy nhiên, sự khác biệt chính giữa Bradford và Lowry Protein Assay nằm ở kỹ thuật đo màu mà họ sử dụng. Xét nghiệm protein Bradford sử dụng màu xanh lam rực rỡ Coomassie G-250 trong khi xét nghiệm protein Lowry sử dụng ion đồng [Cu +] và thuốc thử Folin – Ciocalteu. Hơn nữa, phương pháp Bradford cho kết quả nhanh chóng hơn so với phương pháp Lowry protein. Tuy nhiên, cả hai phương pháp đều là những phương pháp có độ nhạy cao và phải chịu sự can thiệp của nhiều chất khác nhau.