Loading Preview
Sorry, preview is currently unavailable. You can download the paper by clicking the button above.
MỤC LỤCBÀINỘI DUNGTRANG1ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ ACIDE AMIN022HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYM133LIPID, ENZYM DỊCH VỊ VÀ DỊCH TỤY184XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL,TRANG 17PROTEIN TRONG MÁU235XÉT NGHIỆM HÓA SINH NƯỚC TIỂU30BÀI 1ĐỊNH TÍNH PROTEIN VÀ ACIDE AMINI.NỘI DUNG:11/ Phản ứng Ninhydrin2/ Phản ứng Biuret3/ Phản ứng tủa protein bởi nhiệt với môi trường acid yếu4/ Phản ứng tủa protein bởi acid mạnh và không đun nóng5/ Tìm protein trong nước tiểu.Chuẩn bị bộ dụng cụ:Tên dụng cụ1 - Kẹp ống nghiệm2 - Giá đựng ốngnghiệm3 - Ống nhỏ giọt4 - Ống nghiệm nhỏ5 - Ống nghiệm trung6 - Cốc 50 ml7 - Cốc 100ml8 - Pipet 1ml9 - Pipet 2ml10 - Ông đong 5ml11 - Ống đong 10ml12 – Quả bóp cao suĐơn vịCáiCáiSố lượng21CáiCáiCáiCáiCáiCáiCáiCáiCáiCái35202211111II. TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:1.THÍ NGHIỆM 1: Phản ứng Ninhydrina.Nguyên tắc:Dung dịch protein, peptid hoặc acid amin khi đun nóng vớiNinhydrin 0.2% sẽ cho màu xanh tím.Protidt0Dung dịch : Peptid+ Dung dịch Ninhydrin 0,2%Xanh tímAcide aminNinhydrin là một chất oxy hóa nên có thể tạo nên phản ứngkhử carboxyl oxy hóa của acide amin với H 2O, để cuối cùng cho raCO2, NH3 và một aldehyd ngắn đi một carbon so với acide amin2gốc và Ninhydrin bị khử. Sau đó, Ninhydrin bị khử, lại tác dụng lạivới NH3 vừa được phóng thích và kết hợp với một phần tửNinhydrin thứ hai, tạo thành sản phẩm ngưng kết có màu xanhtím.Đây là phản ứng chung cho chác Protid va AA tự do. Phảnứng này cho phéo nhận dạng tất cả các AA có nhóm NH 2 va COOHtự do. Ngoại trừ Prolin và OH Prolin tác dụng với Ninhydrin chomàu vàng.b. Tiến hành:Dung dịchỐng nghiệm 1Nước cất1 mlDd lòng trắng trứngNinhydrin 0,2%Ống nghiệm 21 ml1 ml1mlĐem cả hai ống nghiệm đun cách thủy đến khi có hiện tượngxảy ra, quan sát và nhận xét:3c.Kết quả:Ống nghiệm 1:Không có hiện tượng, màu dung dịch khôngđổi.Ống nghiệm 2: Dung dịch có màu xanh tím.d.Giải thích:Ninhydrin là chất oxy hóa oxy hóa, acid amin CO2 ,NH3,aldehyde ngắn hơn và Ninhydrin bị khử. Sau đó Ninhydrin bị4khử lại tác dụng với NH3 vừa được tạo ra kết hợp với 1 phân tửNinhydrin khác tạo sản phẩm ngưng kết có màu xanh tím.2/ THÍ NGHIỆM 2: Phản ứng Biuret [ Xác nhận các liênkết]a/ Nguyên tắc:Protein tác dụng với Cu ++ trong môi trường kiềm tạo phứcchất màu tím hồng, phản ứng xảy ra do các liên kết peptid.Sở dĩ gọi phản ứng Biuret là do chất Biuret [có nhóm CO –NH, giống như một liên kết peptid] cũng cho phản ứng tương tự,tạo phức hợp có màu giống như protein.b/ Tiến hành:Dung dịch+ DD lòng trắngtrứng+ Nước cất+ DD NaOH 40%+ DD CuSO4 1%Cho vào ống nghiệm:Ống nghiệm 11 ml0,5 ml3 giọtLắc đều,quan sát màu,nhận xét và giải thích:5Ống nghiệm 21 ml0,5 ml3 giọtc/Kết quả:Ống nghiệm 1: Không xảy ra hiện tượng, màu dung dịch cómàu của dd CuSO4 [xanh]Ống nghiệm 2: Xảy ra hiện tượng dung dịch đổi màu [từkhông màu chuyển sang màu tím hồng khi cho CuSO4 vào ] .d/Giải thích:Protein có phản ứng đặc trưng [ xác nhận liên kết peptid ]tạo phức có màu tím hồng đặc trưng với dung dịch CuSO 4.3/ THÍ NGHIỆM 3: Phản ứng tủa Protein bởi nhiệt với môitrường acid yếu1/ Nguyên tắc:Protein hòa tan trong nước hình thành dung dịch keo, trongđó các tiểu phân protein tích điện cùng dấu và mang lớp áonước[ hydrat hóa]. Nhờ tích điện cùng dấu nên các tiểu phân6protein đẩy nhau và nhờ có lớp áo nước nên chúng ngăn cáchnhau, vì vậy dung dịch keo potein bền vững.Nếu làm mất 2 yếu tố trên thì các tiểu phân protein dochuyển động sẽ gặp nhau, dính vào nhau thành những hạt to vàkết tủa.a/ Làm mất điện tích của protein bằng cách:Thêm chất điện giải như NaCl, [NH4]2SO4,.....Hoặc đưa pH của môi trường chứa protein về pH 1 đăng điệncủa protein.Các tiểu phân protein khi đã mất đi điện tích chỉ còn lớp áonước thì dễ bị kết tủa nếu làm mất lớp áo nước thì protein sẽ kếttủa.b/ Làm mất lớp áo nước của protein, bằng cách:Thêm chất khử nước vào môi trường chứa protein[ ví dụ :alcohol, aceton, [NH4]2SO4 ....]Hoặc làm biến tính protein bằng cách đun sôi, thêm acid haykiềm mạnh hoặc muối kim loại nặng.2/ Thuốc thử:+ Dd acid acetic 1% và 10%+ Dd NaCl bão hòa+ Dd NaOH 10%3/ Tiến hành: Cho vào ống nghiệm:Dung dịchLòng trắng trứng đã thẩmtíchAcid acetic 1 %Ống11 mlỐng21 ml2 giọt7Ống31 mlỐng41 mlỐng51 mlAcid acetic 10 %NaCl bão hòaNaOH 10%5 giọt 5 giọt2 giọt2 giọtĐun sôi cách thủy cả 5 ống,nhận xét,ghi kết quả từng ống có tủakhông,giải thích:-Ống 1: Dung dịch trắng đục lợn cợn ít, không tủa nhiều vìcác tiểu phân phân tử Protein dù bị mất lớp áo nước bên ngoàinhưng vẫn còn tích điện.-Ống 2: Có tủ trắng đục vì khi cho 2 giọt A.acetic 1% vào sẽtạo môi trường acid yếu tiểu phân phân tử Protein mất điện tích,PH môi trường đạt gần tới điểm đẵng điện PH1 Protein tủa.8-Ống 3: Không có tủa, vì khi cho them 5 giọt A.acetic 1% vào môi trường acid mạnh nhiều H+ Protein bị khử nước. Phân tửProtein vẫn còn tích điện dương nên không tạo kết tủa.-Ống 4: Có tủa trắng đục, vì khi cho them 5 giọt A.acetic 10%và 2 giọt NaCl bão hòa vào sẽ tạo ra môi trường trung hòa về điện.Do đó sẽ tạo tủa.-Ống 5: Không có tủa, vì khi thêm 2 giọt dung dịch NaOH10% vào sẽ tạo ra môi trường kiềm. Nhóm NH3 được trung hòa. Khiđun sôi điện tích âm của tiểu phân Protein vẫn còn. Do đó sẽkhông tạo tủa.4/ THÍ NGHIỆM 4: Phản ứng tủa bởi acid mạnh vàkhông đun nónga/ Nguyên tắc:Các acid vô cơ mạnh [ HNO3, H2SO4, HCl, ....] và các acid hữucơ [acid Tricloracetic, acid Sulfosalisylic] có tác dụng làm biến tínhvà kết tủa đại đa số Protein.b/ Tiến hành:+ Acid vô cơ:-Ống 1: 2ml H2O + 1ml HNO3 [Không lắc]-Ống 2: 2ml Lòng trắng trứng + 1ml HNO3 [Lắc]Quan sát hiện tượng:9-Ống 1: Không có hiện tượng,dung dịch trong suốt.-Ống 2: Dung dịch có màu trắng đục.+ Acid hữu cơ: A.Sulfosalicylic-Ống 1: 2ml H2O + 1ml A.Sulfosalicylic-Ống 2: 2ml Lòng trắng trứng + 1ml A.Sulfosalicylic [Lắc]Quan sát hiện tượng:10-Ống 1: Không hiện tượng, dung dịch trong-Ống 2: Dung dịch có màu trắng đục,lớp dưới ngã mảu vàng.c/Giải thích:11Protein tạo tủa trong môi trường acid yếu tốt hơn môi trường acidmạnh.5/ THÍ NGHIỆM 5: Tìm protein trong nước tiểua/ Nguyên tắcCác acid vô cơ mạnh [ HNO3, H2SO4, HCl, ....] và các acid hữucơ [acid Tricloracetic, acid Sulfosalisylic] có tác dụng làm biến tínhvà kết tủa đại đa số Protein.b/ Tiến hành:+ Acid vô cơ: HNO3-Ống 1: 2ml nước tiểu + 1 ml HNO3-Ống 2: 2 ml nước tiểu [phòng thí nghiệm] + 1ml HNO3Quan sát hiện tượng:12-Ống 1: Bình thường, không chứa Protein-Ống 2: Có tách lớp, có chứa Protein+ Acid hữu cơ: A.Sulfosalicylic 3%-Ống 1: 2ml nước tiểu + 1ml A.Sulfosalicylic 3%-Ống 2: 2ml nước tiểu [phòng thí nghiệm] + 1mlA.Sulfosalicylic 3%Quan sát hiện tượng:13-Ống 1: Không có hiện tượng, không có chứa Protein-Ống 2: Có hiện tượng vẫn đục, có chứa ProteinBÀI 2HOẠT ĐỘNG CỦA ENZYMS.G.O.T [Serum Glutamic Oxaloacetic Transaminase]. [AST]S.G.P.T [Serum Glutamic Pyruvic Transaminase]. [ALT]14Được tổng hợp từ gan và tim, thuộc nhóm phân hóa tố chuyểnnhóm amin.Xét nghiệm GOT và GPT giúp ta chẩn đoán, theo dõi các bệnh vềgan, tim.Phương pháp ENZYMMATIC [ U.V Test]1. Nguyên tắc:GOT xảy ra theo phản ứng sau đây:α . cetoglutarate + L . Aspartate GOTOxaloacetacOxaloacetac + NaDH + H+MDHGPT xảy ra theo phản ứng sau đây:α . cetoglutarate + L. AlaninGPTPyruvatePyruvate + NaDH + H+ MDHL.Glutamate +L. Malate + NAD+L. Glutamate +L. Lactate + NAD+2. Mẫu thử: [Kim Cương]Huyết thanh hay huyết tương[ kháng đông Heparine].3. Thuốc thử:Dạng KIT pha sẵn, gồm các hóa chất sau đây:3.1.Buffer / Substrate [Reagent 1]Tris buffer pH 7.5L. Aspartate [ GOT] hoặc L. Alanin [ GPT]3.2.4.Enzym / Coenzym [Reagent 2]α. Oxoglutarate.Tiến hành:GOTGPTUUReagent1 1Reagent500500µlµlReagentReagent2 2100µlµl100Sample50 µl15Sample50 µlTrộn đều – Cho vào máy đo-Chọn Test Chọn AST/ALT Chọn water blank [ Đo nước cất] Chọn Sample [Đo mẫu]Đọc kết quả: GOT [AST] : 7 UI /litGPT [ALT] : 4UI /lit Chỉ số nằm trong giới hạn bình thườngXÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘNG AMYLAZ TRONG NƯỚC TIỂU [PPWHOLGEMUTH]:1/ Nguyên tắc:Dùng phương pháp pha loãng dần nước tiểu để tìm lượng enzymtối thiểu phân hủy hết 2 ml dd hồ tinh bột 1% ở 37 0C trong 30phút.Kiểm soát độ phân hủy của hồ tinh bột bằng iode. Tính hoạt độcủa Amylaz theo đơn vị Wholgemuth.Định nghĩa 1 đơn vị Wholgemuth: là lượng Amylaz có khả năngthủy phân 1 ml dd hồ tinh bột 1% ở nhiệt đô 37 0C trong 30 phút.2/ Thuốc thử:-Dung dịch NaCl 9%.Dung dịch iode N/50Dung dịch hồ tinh bột 1%3/ Tiến hành:Lấy 8 ống nghiệm đánh số từ 1 -8Cho vào mỗi ống nghiệm 1 ml dd NaCl 9%.16Cho vào ống 1: 1 ml nước tiểu. Tráng ống hút bằng cách hút lênhút xuống 1-2 lần. Trộn đều.Hút 1 ml của ống 1 cho sang ống 2. Cũng tráng và trộn như ốngtrênHút 1 ml ống 2 sang ống 3. Tiếp tục như vậy đến ống 7. Đến ống7 hút ra 1 ml bỏ đi. Như vậy nước tiểu ở các ông theo thứ tự đãđược pha loãng theo tỉ lệ:123456781ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1ml1mlcủaống11mlcủaống 21mlcủaống 31mlcủaống41ml1mlcủacủaống 5 ống 61/21/41/81/161/321/64NaCl9%NướctiểuTỉ lệLấyra1mlbỏ-Thêm nhanh vào mỗi ống đúng 2 ml hồ tinh bọt 1%, lắc đều. Đểcách thủy 370C trong 30 phút.-Lấy ra cho nhanh vào mỗi ống 2-3 giọt dd iode N/50 . Lắc đều.-Quan sát :17-Từ ống 1 đên ống 5 không có màu, Ống 6 có màu xanh nhạt,ống 7 màu xanh, ống 8 có màu xanh đậm nhất.-Chọn Ống 5 là ống trung gian để biểu diễn kết quả. Hay1/32ml nước tiểu sẽ có khả năng thủy phân 2ml dung dịch hồ tinhbột 1%.-Vậy 1ml nước tiểu sẽ thủy phân 32 x 2 = 64 ml hồ tinh bột. Hoạt động Amylaze theo đơn vị Wohlgemuth là 644/ Biện luận:Bình thường : từ 16 – 32 đơn vị[ Có thể thay đổi từ 8- 64 đơn vị Wholgemuth].Kết luận:Hoạt độ Amylaz ở thí nghiệm trên là 64 đơn vị Wholgemuth.Chưa xuất hiện dấu hiện của bệnh lý.Ngoài ra, trong viêm tụy cấp, Amylaz niệu có thể tăng quá 200 đv, đôi khí lên tới 4000 – 5000 đv. Trị sô tối đa vào lúc 12 -24 giờ, sau18khi xuất hiện nhũng triệu chứng đầu và trở lại bình thường sau 23 ngày. Vì trị số Amylaz trong nước tiểu rất hay thay đổi , nên nếuchỉ định lượng trong mẫu nước tiểu thì kết quả sẽ ít chính xác hơnkhi kết hợp với Amylaz huyết thanh.Trường hợp có suy thận, định lượng Amylaz [ huyết thanh và nướctiểu] đều không có giá trị chuẩn đoán.Amylaz giảm chỉ có ý nghĩa rất ít.19Bài 3:LIPID, ENZYM DỊCH VỊ VÀ DỊCH TỤYA/ NGUYÊN TẮC:Lipid thuộc nhóm các hợp chất không tan hoặc ít tan trongnước và dung môi phân cực, dễ tan trong các dung môi hữu cơ[ không phân cực] như: Cloroform, metanol, benzen, ether,....Nhũ tương dầu trong nước là một nhũ tương không bền, khicho thêm một chất nhũ tương hóa như: xà phòng, muối mật,protein, ...... sẽ được nhũ tương bền.Thủy phân chất béo trong môi trường kiềm mạnh như: NaOH,KOH, đun nóng cho xà phòng và glycerol [ gọi là sự xà phòng hóa].Lipid đóng vai trò quan trọng trong việc tham gia cấu tạo cácmô động vật, cung cấp năng lượng cho cơ thể.Lipid thức ăn đưa vào cơ thể [ chủ yếu là Triglycerid] nhờ cácmen tiêu hóa: Lipaz và các men khác được thủy phân để tạo thànhnhững chất: acid béo, glycerol, sphingozin, cholesterol cùng mộtsố sản phẩm thủy phân không hoàn thành như mono và diglycerid.Những sản phẩm trên lại được tổng hợp lại thành Lipid tại tế bàoruột vào hệ tuần hoàn, phần lớn đi theo đường bạch huyết dướidạng kết hợp Lipoprotein – chất này ở máu, dưới tác dụng của menLipoprotein lipaz lại được phân hủy thành các sản phẩm glycerol,acid béo,…… Acid béo được thoái hóa theo con đường β oxy hóatạo thành những mẫu acetyl coenzym A. Quá trình này xảy ra chủyếu ở gan. Một phần acetyl coenzyme A vào chu trình Krebs tạothành CO2 và H2O. Trong điều kiện rối loạn chuyển hóa, acetylcoenzym A cũng có thể tích tụ lại đẻ tạo thành những sản phẩm20acid aceto acetic, acid β hydroxyl butyric và eceton; 3 chất này cótên chung là Cetonic [ thể Ceton]. Sự gia tăng của các chất Cetontrong máu gây hiện tượng nhiễm acid đồng thời kéo theo sự bàixuất các chất này qua nước tiểu.B/ TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM:Thí nghiệm 1: Khảo sát tính hòa tanThí nghiệm 3: Sự nhũ tương hóaThí nghiệm 4: Tìm thể ceton trong nước tiểuThí nghiệm 1: Khảo sát tính hòa tanCho vào 2 ống nhiệm:Ống 1Ống 2Dầu ăn5 giọt5 giọtNước cất1 ml0Alcol 701 mlLắc kỹ, mạnh trong 5 phút, để yên 15 phút ,quan sát.*Kết quả:-Ống 1: Sau khi lắc hỗn hợp đục, sau đó để yên 15 phút dungdịch tách lớp.-Ống 2: Sau khi lắc hỗn hợp đục, sau đó để yên 15 phút ống vẫnđục như ban đầu.*Kết luận : Lipid [dầu ăn] không tan trong nước, Lipid tantrong AlcolThí nghiệm 2: Sự nhũ tương hóaNhũ tương dầu/ nước là 1 nhũ tương không bền, khi cho thêm1 chất làm nhũ tương bền hơn như: xà phòng, muối mật, protein,Na2CO3, lecithin... gọi là chất nhũ hóa.*Tiến hành:Cho vào 3 ống nghiệm:21Nước cấtDầu ăn 10%Na2CO3 10%Xà phòngỐng 110 ml1 giọt10 giọtỐng 210 ml1 giọtỐng 310 ml1 giọt10 giọtLắc mạnh để yên trong 5 phút*Nhận xét các ống,giải thích các hiện tượng xảy ra:*Kết quả:-Ống 1 và ống 2: Sau khi lắc hỗn hợp đục, sau khi để yên cả2 ống 1 và 2 đều đục nhưng ống 1 đục nhiều hơn ống 2.-Ống 3: đầu tiên hỗn hợp đục, sau khi để yên bị tách lớp.*Kết luận: Dầu ăn không tan trong nước, Na2CO3 là xàphòng là chất nhũ hóa và xà phòng có tác dụng nhũ hóa mạnhhơn Na2CO3.22Thí nghiệm 3: Tìm thể ceton trong nước tiểu* Nguyên tắc:Sodium nitroprussiat tác dụng với chất ceton cho ra phức chấtmàu tím, phản ứng này xảy ra trong môi trường kiềm.OHCeton + Na nitroprussiatphức chất màu tím*Thuốc thử:-Sodium nitroprussia 10% trong nước – Bảo quản trong tốinhưng dung dịch này cũng mau chuyển sang màu xanh ve,-khi do phải pha lại.Acid acetic kết tinh.NH4OH đậm đắc.*Tiến hành:Cho vào 2 ống nghiệm :Ống 1Nước tiểuỐng 220 giọtNước tiểu PTN20 giọtAcid acetic đâm đặc2 giọt2 giọtSodium nitroprussia10%2 giọt2 giọt1ml1mlNH4OH đậm đặc[Trộn đều, hút 10 giọt NH4OH đậm đặc, nghiêng ống nghiêm 450 ;nhỏ cẩn thận theo thành ống. Quan sát sau vài phút.]23*Kết quả:-Cả 2 ống đều có hiện tượng tách lớp-Ống 1: Không có vòng tím ở mặt phân cách trong mẫukhông có ceton-Ống 2: Có vòng tím xuất hiện ở mặt phân cách của 2 dungdịch trong mẫu có ceton*Giải thích:Ống 2 có màu tím ở mặt phân cách do trong mẫu có ceton vàceton sẽ tạo phức có màu tím với Sodium nitroprussia 10% trongmôi trường kiềm [ vai trò của NH4OH]24BÀI 4:XÉT NGHIỆM GLUCOSE, CHOLESTEROL,PROTEIN TRONG MÁUCHUẨN BỊ DỤNG CỤ:Dụng cụSốlượng6 ống1 cái1 cái2 cái1 cái2 cái2 cáiỐng nghiệm nhỏGiá ống nghiệmMicropipet 100-1000 µlMicropipet 10-100 µlMáy quang phổ kếCốc 50 mlCốc 100 mlNỘI DUNG TIẾN HÀNH:+ Định lượng glucose trong máu+ Đinh lượng cholesterol trong máu+ Định lượng protein trong máuA/ ĐỊNH LƯỢNG GLUCOSE TRONG MÁU-Glucose có nguồn gốc từ thức ăn hoặc được tân tạo từ các acidamin và các sản phẩm thoái hóa của Lipid do gan đảm nhiệm tổnghợp.-Mục đích của xét nghiệm Glucose giúp ta chẩn đoán và theo dõibệnh tiểu đường.I/ Nguyên tắc:25