Ý nghĩa phương pháp tách chiết ADN

BioMedia

Tách chiết bằng phenol là một phương pháp thường được sử dụng để loại bỏ protein ra khỏi một mẫu ADN, ví dụ như mẫu ly giải tế bào trong quá trình tách chiết ADN hệ gen. Mặc dù được sử dụng rộng rãi nhưng phương pháp này không được nhiều người nắm rõ.

Nếu muốn hiểu rõ phương pháp này hoạt động như thế nào thì hãy đọc tiếp dưới đây.

Quy trình căn bản

Chúng ta sẽ bắt đầu với những nét chính về các bước của quy trình tách chiết. Đầu tiên, một lượng phenol được thêm vào hỗn hợp dịch lỏng chứa protein và ADN cần tinh sạch.

Vì phenol và nước không tan vào nhau nên hình thành hai lớp dung dịch: lớp nước (dịch lỏng hỗn hợp ở trên) và lớp phenol. Phenol nặng hơn nước nên nằm ở dưới.

Sau đó trộn kỹ hai lớp này với nhau. Phenol trộn với lớp nước sẽ tạo thành nhũ tương giọt dầu trong nước. Các protein có trong nước sẽ bị biến tính và hòa vào trong phenol, trong khi ADN vẫn ở nguyên trong nước.

Sau khi hỗn hợp được đem ly tâm, hai lớp phenol và nước lại tách nhau ra. Lớp nước bên trên chứa ADN được hút ra và phần dịch phenol có protein sẽ bị loại bỏ. Thường thì sau đó ADN sẽ được loại muối và kết tủa bằng ethanol.

Đầu tiên, cần nói một chút về các dung môi…

Để giải thích tại sao việc thêm phenol vào lại có thể phân tách ADN và protein, chúng ta cần đề cập tới các dung môi.

Dung môi là một chất, thường là dung dịch lỏng có thể hòa tan các chất khác. Nói rộng ra, các dung môi có thể được phân loại theo tính phân cực của chúng, phụ thuộc vào sự chênh lệch về mật độ điện tích trên phân tử.

Nước là dung môi rất phân cực bởi vì nguyên tử oxy có độ âm điện lớn vì thế nó “hút” các điện tử về phía nó và cách xa với vị trí của các nguyên tử hydro, điều này tạo ra điện tích âm trên oxy và điện tích dương trên nguyên tử hydro, chính sự chênh lệch điện tích này đã tạo ra sự phân cực cho nguyên tử nước.

Phenol là một phân tử ít phân cực hơn nước. Mặc dù nó có nguyên tử oxy với độ âm điện cao nhưng lại được trung hòa bởi cấu trúc vòng phenyl cũng có độ âm điện rất lớn, vìvậy không có sự tập trung mật độ điện tích xung quanh nguyên tử oxy, dẫn đến không có sự phân cực lớn trong phân tử phenol.

ADN tan tốt nhất trong nước

Vậy điều này giúp gì cho việc phân tách ADN và protein?

Nhìn chung thì các hợp chất phân cực hòa tan tốt nhất trong các dung môi phân cực còn các phân tử không phân cực hòa tan tốt nhất trong các dung môi không phân cực.

ADN là một phân tử phân cực do các điện tích âm trên khung phosphate, vì vậy nó rất dễ tan vào trong nước và khó tan hơn vào phenol. Điều này nghĩa là khi nước (+ADN +protein) và phenol được trộn lẫn vào với nhau, ADN sẽ không tan vào phenol mà sẽ ở lại trong nước.

Độ tan của protein bị thay đổi bởi phenol

Nhưng, protein lại là một câu chuyện hoàn toàn khác.

Như các bạn biết, protein được tạo thành từ các chuỗi dài các amino acid. Mỗi amino acid có đặc tính riêng, do bản chất của các nhóm bên. Một vài amino acid như phenylalanine, leucine và tryptophan không phân cực bởi vì các nhóm bên của chúng chứa tiểu phần không mang điện. Ngược lại, các amino acid có các nhóm bên chứa tiểu phần mang điện thì chúng phân cực (ví dụ như glutamate, lysine and histidine).

Sự khác nhau về tính phân cực của các nhóm bên rất quan trọng về mặt sinh học bởi vì chúng xác định cách thức mà chuỗi peptide cuộn gập thành các protein có chức năng. Đơn giản hơn là, các chuỗi peptide cuộn gập theo cách mà càng nhiều các nhóm bên ít phân cực hơn nằm phía trong protein càng tốt (tránh xa dung môi), trong khi những nhóm bên có tính phân cực tương tự với dung môi được phân bố ở bên ngoài protein. Một cách giải thích khác là các nhóm bên phân cực thì ưa nước và các nhóm bên không phân cực thì kỵ nước. Các nhóm bên kỵ nước thì trốn ở bên trong protein còn các nhóm ưa nước thì ở bên ngoài.

Trong tế bào chất, các protein được cuộn gấp lại dưới sự ảnh hưởng của dung môi là nước, nhưng khi protein tiếp xúc với các dung môi ít phân cực hơn, như phenol chẳng hạn, thì cách cuộn gấp của chúng thay đổi.

Về cơ bản thì cấu trúc protein“lộn từ trong ra ngoài” khi nó ở trong phenol. Những thành phần ít phân cực hơn được giấu bên trong khi protein trong nước, giờ muốn tương tác với phenol nên chúng lộn ra ngoài. Ngược lại, các thành phần phân cực lại bị lộn vào trong của một protein cấu trúc hình cầu để được bảo vệ khỏi dung môi mới không thích hợp.

Nói tóm lại, protein bị biến tính vĩnh viễn bởi môi trường dung môi mới là phenol. Khi ở trong nước các thành phần phân cực ở bề mặt của protein khiến nó tan tốt; còn khi tiếp xúc với phenol, sự thay đổi cấu trúc cuộn gấp do phenol ép các thành phần ưa phenol ra phía ngoài vì thế khiến cho protein trở nên dễ tan trong phenol hơn là trong nước.

Đây chính là cơ sở cho việc phân tách. Các protein tan trong phenol bị phân tách vào trong lớp phenol, như đã thảo luận ở trên, còn các phân tử ADN phân cực dễ tan trong nước thì vẫn ở nguyên trong lớp nước. Đó chính là cơ chế của việc tinh sạch ADN sử dụng phenol.

Dịch và tổng hợp từ Bitesizebio.com

BioMedia VN

BioMedia

Nguồn ảnh: http://bitesizebio.s3.amazonaws.com/

Hiện nay hầu hết các phòng thí nghiệm đều sử dụng bộ kit thương mại gồm cột spin (spin column) chứa các hạt silic để tách chiết ADN hoặc ARN có ưu điểm nhanh chóng và đơn giản hơn so với phương pháp tách chiết thủ công. Tuy nhiên, phương pháp này cũng đòi hỏi những hiểu biết nhất định về bộ kit để đạt được hiệu quả tách chiết cao nhất và tránh những sai sót trong quá trình thực hiện. Vì vậy, trong bài này chúng tôi sẽ giải thích chi tiết các bước thực hiện cũng như một số lưu ý về các vấn đề gặp phải trong quá trình tách chiết acid nucleic bằng cột silic.

Bước 1: Quá trình ly giải (lysis)

Thành phần và nồng độ đệm ly giải thay đổi tùy theo mục đích tách chiết là ADN hoặc ARN, nhưng về cơ bản đều chứa các muối chaotropic (guanidine HCL, guanidine thiocyanate, urea và lithium perchlorate) ở nồng độ cao, làm mất tính bền vững của liên kết hydro, lực Van der Waals và các tương tác kỵ nước. Do đặc tính này, các chất chaotropic có một số tác dụng sau: 1) ly giải màng tế bào, 2) biến tính protein, ADN và các đại phân tử khác, 3) bất hoạt nuclease, 4) thúc đẩy quá trình gắn acid nucleic vào silic. Ngoài ra, một số chất tẩy rửa (detergent) và enzyme (thường dùng là proteinkinase hoặc lysozyme) cũng được sử dụng nhằm tăng hiệu quả hòa tan protein và quá trình ly giải.

Cần lưu ý trong quy trình tách chiết ADN plasmid, các chất chaotropic không được thêm vào dung dịch ly giải với mục đích tách plasmid khỏi ADN hệ gen trước, tránh trường hợp cả plasmide và ADN hệ gen đều được giải phóng cùng một lúc vì rất khó để phân tách ADN mạch vòng nhỏ với ADN hệ gen có trọng lượng phân tử cao.

Bước 2: Gắn ADN hoặc ARN vào cột sắc ký

Ngoài các muối chaotropic, cồn cũng được sử dụng để tăng khả năng gắn của acid nucleic vào silic, thường dùng là ethanol hoặc đôi khi là isopropanol. Việc tối ưu hóa lượng ethanol để tăng hiệu suất tách chiết acid nucleic cũng là vấn đề cần quan tâm. Quá nhiều ethanol sẽ làm ADN bị đứt gãy thành nhiều đoạn nhỏ ảnh hưởng đến khả năng đọc UV ở bước sóng 260nm, ngược lại quá ít ethanol sẽ gây khó khăn cho bước rửa muối trên màng.

Để kiểm tra hiệu quả gắn ADN lên cột, có thể lấy phần dịch chảy qua màng và kiểm tra sự có mặt của ADN quan tâm. Nếu bạn sử dụng chất tẩy rửa có chứa SDS trong quá trình ly giải, hãy thử sử dụng NaCl như một chất kết tủa để tránh việc nhiễm ADN hoặc ARN với chất tẩy rửa.

Nguồn ảnh: https://upload.wikimedia.org

Bước 3: Rửa ADN (hoặc ARN)

Đây là bước cần thiết để loại bỏ các thành phần còn sót lại trên màng như protein, polysaccharide hay thậm chí là chất màu nhằm đạt hiệu suất tách chiết và tinh sạch ADN hoặc ARN cao. Muối còn sót lại làm giảm quá trình rửa giải acid nucleic đưa đến kết quả đọc UV ở bước sóng A230 cao và tỷ lệ UV 260/230 thấp. Vì thế, một vài bộ kit thực hiện bước rửa bằng ethanol tới 2 lần.

Về cơ bản có 2 cách rửa mẫu. (1) Nếu mẫu chứa nhiều protein và các chất màu, cần sử dụng các chất chaotropic ở nồng độ thấp để loại bỏ các tạp chất trước và tieps theo dùng ethanol để loại bỏ chất chaotropic. (2) mẫu không chứa nhiều protein như quá trình tách chiết ADN plasmid hoặc tinh sạch sản phẩm PCR, thì có thể chỉ cần dùng ethanol để thực hiện quá trình rửa.

Bước 4: Loại ethanol bằng cách làm khô

Thực hiện ly tâm làm khô cột nhằm loại ethanol. Nếu cột lọc vẫn còn sót lại ethanol, nucleic acid không thể bị hydrate hóa đầy đủ dẫn tới hiệu suất tách chiết ADN thấp

Vấn đề gặp phải là không thể nhận biết ethanol còn sót lại trong mẫu tách chiết thông qua kết quả đo UV. Do vậy, cách nhận biết mẫu nhiễm ethanol là mẫu không chìm xuống gel agarose khi thực hiện bước tra mẫu kể cả khi có loading dye hoặc qua hiện tượng mẫu không đông lại khi ở trong điều kiện -20° C.

Bước 5: Rửa giải ADN hoặc ARN được gắn vào cột

Đối với ADN, do đặc tính ổn định ở môi trường pH kiềm nhẹ và tan nhanh trong đệm nên đệm Tris HCl 10mM ở pH nằm trong khoảng 8-9 thường được sử dụng làm đệm rửa giải. Ngược lại ARN lại ổn định tốt trong môi trường pH acid nhẹ và hòa tan hoàn toàn trong nước nên nước là dung dịch phù hợp để rửa giải (pH của nước thường nằm trong khoảng 4-5). Quá trình rửa giải đạt hiệu quả cao nếu ủ dung dịch rửa giải ở màng vài phút trước khi ly tâm.

Những vấn đề gặp phải khi tách chiết ADN hoặc ARN bằng kit và cách khắc phục

Hiệu suất tách chiết thấp: có thể do các nguyên nhân sau: (1) do giai đoạn ly giải, (2) điều kiện cho quá trình gắn không đúng, hãy đảm bảo rằng ethanol sử dụng có chất lượng tốt (100%), ethanol chất lượng thấp hoặc cũ có thể hút nước từ bên ngoài dẫn tới nồng độ không còn chính xác. (3) Nếu đệm rửa không chính xác cũng giảm hiệu quả gắn ADN hoặc ARN vào cột dẫn tới hiệu suất tách chiết thấp.

Độ tinh sạch thấp: nếu ADN tách chiết bị nhiễm protein (tỷ lệ 260/280 thấp) có thể do lượng mẫu sử dụng quá nhiều và protein không được loại bỏ hoàn toàn. Trường hợp ADN có tỉ lệ 260/230 thấp có thể do muối từ quá trình gắn hoặc đệm rửa vẫn còn sót lại. Hãy đảm bảo rằng ethanol chất lượng cao nhất được dùng để làm đệm rửa và nếu vấn đề vẫn tiếp tục xảy ra, cần có thêm một bước rửa nữa.

Thoái hóa: Điều này cần quan tâm khi tách ARN. Chủ yếu khi tách ARN, sự thoái hóa diễn ra do bảo quản mẫu không đúng cách hoặc quá trình lysis không tốt, cần phải đảm bảo việc rửa giải bằng nước không chứa RNAase. Đối với tách chiết ADN, sự thoái hóa không phải là một vấn đề lớn bởi vì đối với PCR, dù ADN bị đứt gãy thì nó vẫn hoạt động tốt. Nhưng nếu bạn thấy ADN bị đứt gãy quá nhiều, có thể là do bạn đã sử dụng bước ly giải quá mạnh.

Các lưu ý trong quá trình tinh sạch sản phẩm PCR: thực chất đây không phải là kỹ thuật tách chiết ADN, chỉ đơn giản thêm các muối gắn ở nồng độ cao (thông thường thể tích muối trên mỗi thể tích phản ứng PCR khoảng 3-5 ) và ly tâm cột. Do đó khi tinh sạch sản phẩm PCR bằng kit thất bại, câu hỏi đầu tiên cần đặt ra là “bạn có kiểm tra kết quả phản ứng PCR trên gel hay không?” vì không thể kiểm tra sản phẩm phản ứng PCR bằng cách đo UV để có kết quả chính xác vì có rất nhiều chất trong phản ứng PCR hấp thụ ở bước sóng UV 260 nm như: nucleotide, chất tẩy, muối và mồi. Theo kinh nghiệm, sự thất bại quá trình tinh sạch PCR bằng kit là do thất bại ở phản ứng PCR, nhưng nếu bạn biết có nhiều sản phẩm PCR, cách tốt nhất là bạn nên giữ lại các phân đoạn chảy qua sau khi gắn. Nếu có ADN ở đó tức là chúng không gắn vào cột, bạn có thể rửa lại một lần nữa, và có thể gọi người hỗ trợ kỹ thuật và yêu cầu thay thế bộ kit.

Dịch và tổng hợp từ Bitesizebio.com

BioMedia VN