VS.QTKT.NC.09.QUY TRÌNH NUÔI CẤY PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ NƯỚC TIỂU
[Cập nhật: 6/7/2020]
VS.QTKT.NC.09.QUY TRÌNH NUÔI CẤY PHÂN LẬP VI KHUẨN TỪ NƯỚC TIỂU
I. MỤC ĐÍCH
Mô tả quy trình kỹ thuật nuôi cấy, theo dõi và trả kết quả bệnh phẩm nước tiểu cho nhân viên phòng nuôi cấy thực hiện.
II. PHẠM VI ÁP DỤNG
Quy trình này áp dụng cho các nhân viên phòng nuôi cấy, khoa Vi sinh, Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh.
III. TÀI LIỆU VIỆN DẪN
- Diagnostic Microbiology – 4thEdition – Washington, Philadelphia
- Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology-9thEdition-William & Wilkin
- Manual of Clinical Microbiology – 8thEdition – Washington DC – Patrick R.Murray.
- Kỹ thuật xét nghiệm Vi sinh lâm sàng [Nhà xuất bản Y học, 2006].
IV. TRÁCH NHIỆM
Nhân viên xét nghiệm khoa vi sinh- Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh có trách nhiệm thực hiện theo đúng quy trình
Người thực hiện: Cán bộ xét nghiệm đã được đào tạo và có chứng chỉ hoặc chứng nhận về chuyên nghành vi sinh, làm việc tại khoa Vi sinh - Bệnh viện đa khoa tỉnh Quảng Ninh
V. ĐỊNH NGHĨA, THUẬT NGỮ, CHỮ VIẾT TẲT
Định nghĩa
Giải thích thuật ngữ
Từ viết tắt
- SOP = Quy trình chuẩn [Standard of Procedure]
- KXN = Khoa Xét nghiệm
- BA = Thạch máu
- MC = Thạch macconkey
- CHL = Thạch chromatic detection
- UTI = Thạch Uti
VI. NGUYÊN LÝ
Dùng ăng chuẩn để cấy đếm trên môi trường thích hợp từ đó tính ra số lượng vi khuẩn có trong 1ml nước tiểu.
VII. TRANG THIẾT BỊ
Thiết bị
- Tủ an toàn sinh học
- Tủ ấm CO2
- Tủ ấm Memmert
- Kính hiển vi
Dụng cụ
- Đèn cồn
- Que cấy
- Giá để bệnh phẩm
- Dầu soi
Hóa chất, thuốc thử
- Thạch máu, thạch macconkey
- Các môi trường, hóa chất cho định danh vi khuẩn
- Bộ thuốc nhuộm Gram
VIII. NỘI DUNG
1. Bệnh phẩm
Nước tiểu: bệnh phẩm phải có đầy đủ thông tin, đủ số lượng theo yêu cầu xét nghiệm, lọ đựng bệnh phẩm phải được đậy chặt.
2. Kỹ thuật tiến hành
- Để môi trường nuôi cấy vào tủ ấm 37oC trong 10 - 15 phút;
- Nước tiểu được lắc và trộn đều;
- Dùng que cấy định lượng 1 µl/pipete hút 1 µl lấy nước tiểu ria cấy trên khắp bề mặt môi trường BA hoặc MC
- Cho khoảng 3ml vào tube thủy tinh vô trùng 5ml đem ly tâm với tốc độ 3000 vòng/10 phút;
- Chắt bỏ nước nổi, lấy cặn phết lam nhuộm Gram đánh giá sơ bộ bệnh phẩm
- Để đĩa thạch đã nuôi cấy vào tủ ấm 37oC trong 18- 24giờ.
- Bắt khuẩn lạc nghi ngờ là vi khuẩn gây bệnh, mọc riêng rẽ và số lượng chiếm ưu thế
- Nhuộm soi Gram khuẩn lạc, thử nghiệm các thử nghiệm sinh vật hóa học đơn giản và định danh bằng các bộ sinh vật hóa học [Bộ API …]
- Chọn khuẩn lạc riêng rẽ, nghi nghờ gây bệnh ria cấy phân lập trên môi trường định danh [CHL hoặc UTI]
- Định danh vi khuẩn gây bệnh bằng test sinh vật hóa học, thanh giá đường API hoặc máy VITEK2- COMPACT tùy theo từng loại vi khuẩn.
IX. PHIÊN GIẢI KẾT QUẢ
1. Dương tính: Phân lập và định danh được vi khuẩn gây bệnh. Trả kết quả tên vi khuẩn đến mức độ chi hoặc loài.
+ Đếm số lượng khuẩn lạc có mặt trên đĩa thạch và x1000 -> được số lượng vi khuẩn/ml. Chỉ trả với những trường hợp số lượng khuẩn lạc đếm trên đĩa thạch ≥ 10 [tính riêng cho từng loại vi khuẩn];
+ Nếu ≥ 3 loại khuẩn lạc thì bệnh phẩm được xem là nhiễm bẩn, đề nghị lấy bệnh phẩm mới;
- Trả lời số lượng vi khuẩn/ml
+ Nếu số lượng vi khuẩn ≥ 105/ml và đối với trẻ em là 104/ml thì trả kết quả dương tính là ≥ 105 vi khuẩn/ml [104 đối với trẻ em]
+ Nếu số lượng vi khuẩn 104 - 105/ml thì trả kết quả theo số lượng khuẩn lạc đếm được trên đĩa thạch đã nuôi cấy
2. Âm tính: Không tìm thấy hoặc không phân lập được vi khuẩn gây bệnh
X. KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG
- BA, MC, CHL, UTI phải kiểm tra hàng tuần trước khi sử dụng
- Thuốc nhuộm kiểm tra hàng tuần
- Kết quả QC phải có sự ghi chép
XI. AN TOÀN
- Thực hiện bảo hộ cá nhân đầy đủ khi tiếp xúc với bệnh phẩm.
- Các bước phải được tiến hành trong tủ ATSH.
- Xử lý bệnh phẩm theo đúng quy đinh, phòng tránh lây nhiễm chéo.
XII. HỒ SƠ LƯU
- Sổ đọc kết quả bệnh phẩm
- Sổ lưu kết quả nuôi cấy
XIII. TÀI LIỆU LIÊN QUAN
- Quyết định số 26/QĐ-BYT, ngày 03/01/2013 Về việc ban hành tài liệu: “Hướng dẫn quy trình kỹ thuật chuyên ngành Vi sinh”
Xét nghiệm giúp định danh được loại vi khuẩn gây nhiễm trùng tiểu, giúp Bác sĩ lâm sàng có hướng sử dụng Kháng sinh đồ phù hợp.
|
Tên xét nghiệm: |
Cấy nước tiểu + KSĐ |
|
Ý nghĩa: |
Là xét nghiệm được sử dụng để hướng dẫn cách thực hiện nuôi cấy, định lượng và định danh một số vi sinh vật thường gây nhiễm trùng đường tiết niệu. |
|
Diễn giải: |
Sử dụng phương pháp cấy định lượng và các môi trường thạch dinh dưỡng nhằm phát hiện vi khuẩn hiện diện trong nước tiểu + < 104CFU/ml : Không phát hiện vi khuẩn gây nhiễm trùng tiểu. + 104 - 105CFU/ml. Nếu bệnh nhân không có triệu chứng nhiễm trùng tiết niệu: đề nghị lấy 1 mẫu nước tiểu nữa và tiến hành nuôi cấy định lượng lại. Nếu bệnh nhân có triệu chứng nhiễm trùng tiết niệu + mẫu cấy có 1 hay 2 loại vi khuẩn: tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ. + > 105CFU/ml + mẫu cấy có 1-2 loại vi khuẩn Tiến hành định danh và làm kháng sinh đồ Nếu mẫu cấy có có trên 2 loại vi khuẩn ở trường hợp 2 và 3: báo cáo kết quả: “Mẫu tạp nhiễm, đề nghị cấy lại |
|
Xét nghiệm Cấy NT+ KSĐ thường được sử dụng chẩn đoán và theo dõi: + Nghi ngờ nhiễm trùng tiểu. |
|
|
Xét nghiệm liên quan |
Cặn lắng nước tiểu, Tổng phân tích nước tiểu. |
|
Hướng dẫn trước khi lấy mẫu: |
Bạn nên thực hiện xét nghiệm này vào buổi sáng sớm Vệ sinh sạch sẽ vùng kín trước khi lấy mẫu. |
MẪU NƯỚC TIỂU VÀ CẤY NƯỚC TIỂU
1. CHỈ ĐỊNH CẤY NƯỚC TIỂU
- Các trường hợp bác sĩ lâm sàng nghi ngờ nhiễm trùng nước tiểu [NTT] cấp tính, mạn tính, có triệu chứng hay không có triệu chứng.
- Nên cho chỉ định cấy nước tiểu đối với các bệnh nhân có một trong các triệu chứng nghi ngờ bệnh nhân bị [1] nhiễm trùng bàng quang như đái ra mủ, đái khó, đái ra máu, đái đau, đau tức vùng trên xương mu hay bụng dươí, hay [2] nhiễm trùng thận như đau lưng, tức căng vùng góc sống - sườn.
2. THỜI ĐIỂM CẤY NƯỚC TIỂU
- Tốt nhất là buổi sáng, lấy trước khi bệnh nhân dùng kháng sinh.
- Trong đêm, bệnh nhân cố nhịn tiểu cho đến khi lấy mẫu.
3. CÁCH LẤY BỆNH PHẨM
- Nước tiểu nên được lấy vào các lọ vô trùng nắp đậy chặt [lọ vô trùng lấy mẫu]. Tốt nhất là các lọ miệng rộng, hay các ống nghiệm ly tâm nắp chặt. Có thể lấy nước tiểu và cấy ngay tại giường vào chai cấy 2 mặt thạch cấy và định lượng nước tiểu [xem hướng dẫn và qui trình sử dụng 2 chai mặt thạch cấy và định lượng nước tiểu].
- Nước tiểu sau khi lấy xong phải được gửi đến phòng thí nghiệm khảo sát ngay. Nếu chậm trễ, có thể giữ trong tủ lạnh 4[sup]0[/sup]C, nhưng không quá 24h.
- Nước tiểu phải được lấy bằng phương pháp vô trùng. Tránh tối đa sự nhiễm bằnt cơ quan sinh dục ngoài. Sau đây các phương pháp lấy nước tiểu từ bệnh nhân.
3.1. Đối với phụ nữ hay trẻ gái lơn, bệnh nhân tự làm hay điều dưỡng giúp.
- Rửa tay kỹ bằng xà phòng, nước rồi lau khô bằng khăn sạch.
- Cởi quần, vạch âm môi, rửa sạch rồi thấm xà phòng trong ra ngoài bằng bông hay gạc vô trùng.
- Rửa sạch xà phòng rồi thấm khô bằng gạc vô trùng. Suốt quá trình vẫn dùng tay vạch âm môi không cho đụng vào phần bên trong.
- Tiểu bỏ phần đầu, lấy nước tiểu phần còn lại.
3.2. Đối với đàn ông hay trẻ trai lớn, bệnh nhân tự làm hay điều dưỡng giúp
- Rửa sạch tay như trên
- Kéo phần da qui đầu tụt ra sau.
- Rửa sạch cũng như trên
- Tiểu bỏ phần đầu, lẫy phần còn lại.
3.3. Đối với trẻ nhở, khó lấy hơn vì bệnh nhân không biết hợp tác
- Trước khi lấy nước tiểu nên cho bệnh nhân uống nhiều nước.
- Cho bệnh nhân ngồi trên đùi mẹ, rửa sạch bộ phận sinh dục ngoài rồi xi bé tiểu, hứng lấy nước tiểu càng nhiều càng tốt.
3.4. Có thể lấy bằng các phương pháp khác
- Chọc qua da trên xương mu.
- Bằng ống thông tiểu hay qua nội soi bàng quang.
4. KHẢO SÁT TRỰC TIẾP
Trộn đều nước tiểu rồi nhỏ 1 giọt trực tiếp trên lam. Chờ khô tự nhiên rồi nhuộm gram. Quan sát dưới vật kính dầu
- Nếu có ít nhất 1 tế bào vi khuẩn và /hay bạch cầu hiện diện trên một quang trường, có thể nghi ngờ bệnh nhân bị nhiễm trùng tiểu. Có thể làm kháng sinh đồ trực tiếp từ mẫu nước tiểu này.
- Nếu toàn phết nhuộm không hay phát hiện được rất ít tế bào vi khuẩn hay bạch cầu, bệnh nhân chắc chắn không bị nhiễm trùng tiểu.
5. CẤY NƯỚC TIỂU
- Dùng vòng cấy định lượng 0.01 [10µl] hay 0.001 [1µl], lấy đầy một vòng cấy, cũng có thể dùng micropipet với đầu tip vô trùng lấy 1µl nước tiều, trải toàn bộ lên bề mặt hộp thạch nuôi cấy [thường là BA hay BANg và MC hay EMB].
- Ủ BA hay BANg trong bình nến, MC hay EMB ủ thường, tất cả trong tử ấm 35 -37[sup]0[/sup]C, để qua đêm.
- Đọc kết quả bằng cách đếm số khóm trùng để biết số lượng vi khuẩn trong mầm cấy ban đầu, sau đó suy ra toàn bộ số lượng vi khuẩn sống [Colony Forming Unit = CFU] trong 1ml nước tiểu. Nếu có:
+ ≤ 10000 CFU/ml nước tiểu, không có nhiễm trùng tiểu.
+ ≥ 100000 FU/ml nước tiểu, chắc chắn có nhiễm trùng tiểu, định danh vi khuẩn và làm kháng sinh đồ.
+ 10000 ≤ 100000 FU/ml nước tiểu, nghi ngờ nhiễm trùng tiểu. Trong trường hợp này, nếu bện nhân có dấu hiệu lâm sàng chắc chắn nhiễm trùng tiểu hay bị nhiễm trùng tiểu tái phát nhiều lần, có thể định danh vi khuẩn phân lập được và làm kháng sinh đồ.
6. KHẢO SÁT SINH HÓA, TẾ BÀO VÀ CẶN LẮNG
- Thực hiện sau khi cấy.
- Đối với sinh hóa, dùng giấy nhúng.
- Quay ly tâm lấy cặn để khảo sát tế bào và cặn lắng.
7. CÁC VI KHUẨN THƯỜNG LÀ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM TRÙNG TIỂU
- Enterobacteriaceae [Escherichia coli, Klebsiella spp, Proteus spp…]
- Enterococcus spp.
- Pseudomonas aeruginosa, và các trực khuẩn không lên men khác.
- Staphylococcus aureus
- S. epidermidis
- S. saprophyticus
- Candida albicans
- M. tubercolosis
8. CẤY NƯỚC TIỂU – CÁC CÂU HỎI THƯỜNG GẶP
8.1. Làm thế nào để lấy đúng nước tiểu làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng?
- Lấy đúng nước tiểu để làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng là phải lấy nước tiểu giữa dòng, lấy bằng phương pháp vô trùng, trong đó quan trọng là phải rửa sạch bộ phận sinh dục ngoài trước khi hứng lấy nước tiểu giữa dòng.
- Dụng cụ đựng nước tiểu để làm xét nghiệm vi sinh lâm sàng cũng phải phù hợp, nghĩa là phải dùng cáclọ vô trùng và có thể hứng lấy nước tiểu dễ dàng cũng như không chảy thấm ra ngoài trong quá trình chuyên chở đến phòng thí nghiệm. Thích hợp nhất là các lọ dung tích 50- 100ml, vô trùng, miệng rộng, có nắp vặn chặt và có nhãn để ghi tên bệnh nhân cũng như các thông tin tối thiểu khác về bệnh phẩm.
- Trên thực tế rất ít khi lâm sàng quan tâm sử dụng đúng dụng cụ lấy nớc tiểu, rất nhiều nơi chỉ dùng các lọ thủy tinh kiểu chai đựng thuốc chích rửa sạch, nhét gòn hay các tube thủy tinh nhét gòn rồi sấy hay hấp để vô trùng. Các vật liệu như vậy không chỉ rất khó hứng nước tiểu giữa dòng mà còn bị thấm ra miệng lọ hay tube gây nguy cơ ngoại nhiễm cho mẫu và còn có thể nguy hiểm cho người xét nghiệm.
- Ngoài ra cũng có nhiều nơi lâm sàng không quan tâm hướng dẫn hay giúp bệnh nhân lấy đúng nước tiểu giữa dòng và lấy vô trùng, thậm chí có khi bệnh nhân lại lấy nước tiểu trong bô để đưa cho lâm sàng. Chính vì vậy mẫu nước tiểu gửi đến phòng thí nghiệm có thể bị ngoại nhiễm và gây sai lệch kết quả.
8.2. Quay ly tâm nước tiểu và làm phết nhuộm gram cặn lắng có giá trị không?
- Hiện nay vẫn có một số phòng thí nghiệm làm phết nhuộm gram cặn lắng nước tiểu sau ly tâm và trả lời cho lâm sàng các hình ảnh gram vi khuẩn họ quan sát được. Thật sự kết quả này không có ý nghĩa gì trong việc cho biết bệnh nhân có hay không bị nhiễm trùng tiểu và bị nhiễm trùng do vi khuẩn gram nào vì đa số các cặn lắng nước tiểu dù không bị nhiễm trùng tiểu vẫn có chứa một ít vi khuẩn do kết quả của sự tạp nhiễm khi nước tiểu đi qua đường sinh dục ngoài.
- Tuy nhiên nhuộm gram cặn lắng nước tiểu sau lý tâm lại rất có giá trị để phát hiện vi khuẩn lậy [N. gonorrhoeae] là các song cầu gram [-] hình hạt cà phê nội tế bào trong các tế bào niêm mạc đường tiểu hay đường sinh dục.
8.3. Nếu chưa thể cấy ngay, có thể lưu mẫu nước tiểu trong tủ lạnh 4[sup]0[/sup]C được không? Và lưu được trong bao lâu?
- Tốt nhất là nước tiểu phải được chuyển đến phòng thí nghiệm ngay sau khi lấy và phải được cấy ngay vì nếu để chậm trễ các vi khuẩn tạp nhiễm sẽ tăng sinh trong nước tiểu và làm sai lệch kết quả cấy định lượng. Chính vì vậy, trong các phiên trực, hay khi không có kỹ thuật viên cấy định lượng nước tiểu, tốt nhất phòng thí nghiệm dùng chai cấy nước tiểu hai mặt thạch vì với phưong tiện này bất cứ ai cũng thực hiện được kỹ thuật cấy định lượng nước tiểu.
8.4. Phát hiện nitrit trong nước tiểu có chính xác không để xác định nhiễm trùng tiểu?
- Phát hiện nitrit để xác định nhiễm trùng tiểu dựa trên nguyên tắc là nếu có nhiễm trùng tiểu, vi khuẩn trong nước tiểu sẽ khử được nitrat trong nước tiểu thành nitrit. Tuy nhiên không phải tất cả các vi khuẩn đều có khả năng này, do vậy vẫn có nhiều trường hợp nhiễm trùng tiểu nhưng khi thử nitrit vẫn âm tính.
- Ngoài phương pháp tìm nitrit, cũng có thể tìm sự hiện diện của bạch cầu trong nước tiểu để xác định nhiễm trùng tiểu vì một khi có nhiễm trùng tiểu thì có phản ứng viêm và có phản ứng viêm là có hiện diện bạch cầu.
- Cả hai phương pháp trên vẫn là các phương pháp gián tiếp phát hiện nhiễm trùng tiểu, không thể cho biết vi khuẩn gây bệnh là vi khuẩn gì và cũng không thể cho biết kháng sinh đồ. Chính vì vậy, phương pháp vi sinh cấy định lượng phát hiện nhiễm trùng tiểu là phương pháp chuẩn nhất và hữa dụng cho lâm sàng nhất.